综述：CRISPR激活技术在植物抗病育种中新型基因的鉴定与应用

这篇综述系统阐述了CRISPR激活（CRISPRa）技术如何通过精准上调内源基因表达来增强植物抗病性，重点探讨了其与功能基因组学（GWAS、多组学）的协同应用、可编程转录激活因子（PTAs）的优化策略，以及实现非转基因过表达的潜力，为作物抗病育种提供了创新范式。

　　

CRISPR激活技术：植物抗病育种的新引擎

引言

随着病原体压力加剧和气候变异性增加，作物抗病性改良成为全球农业的核心挑战。传统育种方法如化学诱变或辐射诱变存在随机性高、筛选效率低等局限，而CRISPRa技术通过无切割活性的dCas9蛋白偶联转录激活因子，实现了对目标基因的精准上调，为植物免疫机制研究和抗病育种开辟了新路径。

CRISPR技术基础与革新

CRISPR-Cas9系统源于细菌适应性免疫机制，其核心组件Cas9核酸酶在sgRNA引导下靶向切割DNA。与传统基因敲除不同，CRISPRa采用失活的dCas9融合转录激活域（如VP64、VPR或植物特异的EDLL结构域），通过表观遗传重塑（如增加H3K4me3修饰）激活内源基因表达，避免了外源DNA插入导致的基因组扰动。在番茄中，dCas9-VP64系统对SlPR-1基因的激活使植株对Clavibacter michiganensis的抗性提升3倍，且不影响农艺性状。

激活策略的进化

早期激活标签技术依赖随机插入增强子，而CRISPRa实现了靶向可控的基因激活。第二代PTAs如SunTag和MoonTag系统通过多价激活域招募策略，在烟草中实现目标基因表达量最高提升2000倍。值得注意的是，菜豆毛状根中应用的dCas9-6×TAL-2×VP64系统使抗菌肽基因Pv-lectin表达量上调6.97倍，显著增强了对病原体的防御能力。

多组学整合与精准设计

将CRISPRa与全基因组关联分析（GWAS）结合，可加速抗病基因鉴定。例如，通过高光谱表型分析结合GWAS定位小麦赤霉病抗性QTL后，采用CRISPRa靶向调控相关转录因子，实现了对镰刀菌毒素积累的精准控制。新型CRISPR-Combo系统更可同步完成基因编辑和转录激活，在拟南芥中使再生效率提升3倍，大幅缩短育种周期。

非转基因策略与产业化前景

通过瞬时递送dCas9-激活复合体或编辑内源启动子元件，可实现非转基因的基因过表达。巴西已批准基于此技术的抗病甘蔗商业化种植，而中国在2024年将基因编辑小麦纳入快速审批通道。但公众认知仍是主要障碍，调查显示仅38%消费者能区分CRISPR编辑与传统转基因作物。

高通量表型分析革命

自动化表型平台（如高光谱成像、3D激光扫描）使大规模CRISPRa筛选成为可能。在针对500个转录因子的激活筛选中，荧光成像可检测到光合效率0.5%的细微变化，比肉眼观察提前72小时发现病害症状。机器学习算法进一步将抗病表型分类准确率提升至92%。

挑战与展望

当前CRISPRa仍面临组织特异性激活困难、递送效率低等问题。未来发展方向包括：开发铜离子诱导型PTAs实现时空特异性激活；设计模块化gRNA库实现抗病通路的多基因协同调控；结合单细胞测序解析抗性细胞的转录组特征。随着表观遗传编辑工具的完善，预计到2030年将有超过20种CRISPRa改良作物进入田间试验阶段。

结论

CRISPRa技术正在重塑植物抗病研究范式，其精准性、可逆性和与多组学工具的兼容性，使其成为实现"设计育种"理想的核心技术。通过持续优化PTAs效率、开发新型递送系统和完善监管框架，这项技术有望为全球粮食安全提供可持续解决方案。