细胞表面波形蛋白膜拓扑结构与互作组的适应性基因组-蛋白质组学解析

本研究通过CRISPR-Cas9在vim基因六个位点插入HA标签，结合免疫检测和邻近生物素化技术，首次系统阐明细胞表面波形蛋白(csVim)完全定位于细胞外表面的膜拓扑特征，并鉴定出EPHA2、EPHB2等5个新型纳米级亲和力互作蛋白，为癌症、病毒感染等csVim相关疾病的干预提供新靶点。

　　

在细胞生物学领域，波形蛋白(Vimentin)长期以来被视为典型的III型中间丝蛋白，主要参与维持细胞骨架结构、细胞迁移和细胞器锚定等胞内功能。然而近年研究发现，这种缺乏信号肽的蛋白竟能神奇地出现在细胞表面甚至被分泌到胞外环境，这种"胞外身份"在血管生成、伤口愈合、微生物感染和自身免疫疾病中扮演着重要角色。更令人困惑的是，细胞表面波形蛋白(csVim)既能作为受体又能作为配体发挥作用，但其膜方向性和完整的互作网络始终是未解之谜。这种知识空白严重阻碍了针对csVim相关疾病（从癌症转移、COVID-19到器官纤维化）的精准干预策略开发。

为破解这一难题，多伦多大学牙科学院的研究团队在《Biochemistry and Biophysics Reports》发表创新性研究。他们采用CRISPR-Cas9基因编辑技术在人类牙龈成纤维细胞(HGF)和脐静脉内皮细胞(HUVEC)中构建了六个位点的HA标签修饰株，通过活细胞表面免疫染色技术确认csVim完全定位于细胞外侧。随后运用抗体引导的邻近生物素化结合质谱分析(AP-MS)，鉴定出包括EPHA2、EPHB2等受体酪氨酸激酶在内的新型互作蛋白，并通过ELISA验证了其中5个蛋白与Vimentin存在纳摩尔级亲和力。

关键技术方法包括：1)基于AlphaFold预测的Vimentin结构设计CRISPR-Cas9敲入策略，在六个非结构化区域插入HA标签；2)优化活细胞表面免疫染色方案，采用冰上操作避免胞内Vimentin干扰；3)建立基于HRP-生物素酪胺的细胞表面邻近标记系统；4)结合SAINTexpress算法进行互作蛋白置信度评分；5)通过体外ELISA测定验证互作亲和力。

【1. Main】研究结果部分：

膜拓扑研究显示，所有HA标签修饰株均保持正常中间丝形成能力，而仅当标签位于预测胞外区域时才被检测到，证明csVim以完全胞外定位方式存在。互作组分析获得20个高置信度候选蛋白，其中EPHA2和EPHB2与Vimentin的结合亲和力(K_d)分别达到20.7 nM和65.3 nM。特别值得注意的是，与SARS-CoV-2刺突蛋白存在互作的TFRC(转铁蛋白受体)和LRRC15也被鉴定为csVim的新型结合伙伴，这为解释Vimentin参与病毒感染提供了新机制。

【2. Methods】方法学创新体现在：

研究团队开发了"双抗体验证"策略，同时使用抗Vimentin和抗HA标签抗体进行互作捕获，有效避免了单一抗体可能导致的表位遮蔽问题。实验设计上采用非克隆混合编辑细胞群体，通过10-30%的编辑效率既保证信号强度又避免克隆变异干扰。

结论部分强调，这项研究不仅解决了csVim膜拓扑的长期争议，更建立了可推广的研究范式：通过基因组编辑引入外源标签，结合蛋白质组学技术，可系统研究其他"孤儿受体"或非常规膜蛋白的结构与功能。发现的互作网络为多种疾病干预提供新思路，例如EPHA2/EPHB2的调控可能影响肿瘤血管生成，而TFRC的阻断或可成为抗病毒新策略。研究也存在一定局限，如HA标签可能影响蛋白天然构象，未来需要开发无标记研究手段进一步验证。

该工作的深远意义在于，它首次将CRISPR基因组编辑与邻近标记蛋白质组学无缝整合，为细胞表面蛋白质研究树立了新标准。正如作者指出，这套"适应性基因组-蛋白质组学方法"可广泛应用于其他具有"兼职"胞外功能的胞质蛋白研究，为理解蛋白质的" moonlighting "现象开辟了新途径。