杨树受体样激酶家族的高通量多重CRISPR编辑：基于细胞悬浮转化技术的创新研究

本研究针对杨树受体样激酶（RLKs）功能冗余导致的基因研究瓶颈，开发了一种基于叶源悬浮细胞转化技术的CRISPR/Cas9高通量编辑平台。通过优化载体池转化策略（4载体/池），研究人员在Populus deltoides × P. euramericana cv. "Nanlin895"中成功构建了4093株T0代转基因株系，靶向182个RLK基因，编辑效率达72.3%，并发现REX1/2/3三突变体导致木质部发育异常。该技术为木本植物基因家族功能解析提供了规模化解决方案。

　　

在植物发育过程中，受体样激酶（Receptor-like kinases, RLKs）作为细胞信号转导的"分子天线"，调控着从生长发育到逆境响应的众多生物学过程。杨树作为多年生木本模式植物，其木质部特异表达的近200个RLK成员被推测参与木材形成调控，但这些基因的功能解析长期面临两大挑战：一是基因家族成员间存在高度功能冗余，传统单一基因敲除难以揭示其真实功能；二是木本植物遗传转化周期长、效率低，难以规模化构建多重突变体。虽然CRISPR/Cas9技术已在拟南芥、水稻等草本植物中实现多重编辑，但在杨树等木本植物中仍缺乏高效的高通量操作平台。

为突破这些限制，来自浙江农林大学和中国科学院分子植物科学卓越创新中心的联合团队在《Plant Communications》发表了创新性研究。研究人员首先建立了直接从杨树叶外植体诱导悬浮细胞的新型培养体系，通过优化2,4-D激素浓度和振荡培养条件，在2-3周内即可获得高活性的单细胞悬浮物。基于此开发了载体池转化策略，将52个四重sgRNA载体分为13个转化池（每组4个载体），通过农杆菌介导的悬浮细胞转化，最终获得4093株独立转基因株系。

关键实验技术

研究采用叶源悬浮细胞直接诱导技术替代传统愈伤组织途径，结合优化的农杆菌转化体系（OD₆₀₀=0.6，共培养48小时）。设计52个CRISPR/Cas9载体，每个载体包含4个由不同U3/U6启动子（U3b、U3d、U6-1、U6-29）驱动的sgRNA表达盒。通过PCR（U3b-F/SPR引物）和测序验证编辑效率，并利用显微观察和phloroglucinol-HCl染色分析木质部表型。

高效悬浮细胞体系的建立

通过比较不同外植体来源，发现叶源悬浮细胞在MS+2,4-D培养基中表现出更优的分散性和增殖速率（补充图S1-S2）。转化实验显示对数生长期（培养7天）的细胞具有最高转化效率，为后续规模化编辑奠定基础。

载体池转化策略优化

测试不同规模载体池（4-12个载体/池）发现，4载体池既能保证100%的载体整合率，又能使每个载体获得40株以上独立转化株（图1D）。这种"小而精"的策略有效避免了载体间的竞争抑制，为功能基因组学研究提供了理想的群体规模。

大规模RLK突变体库构建

靶向182个木质部RLK基因的编辑群体中，72.3%的T₀株系产生有效突变，其中37.3%为纯合/双等位突变（图1F）。突变谱分析显示83.3%为1-2 bp的indels（图1H），且未检测到预测脱靶位点的编辑（附表S3），证实了系统的高特异性。

REX基因功能冗余的揭示

在鉴定出的REX1/2/3（Potri.008G014300等）突变组合中，三突变体V5-28表现出显著矮化（株高降低63.2%）和叶色褪绿（图1J-K）。木质部切片显示其纤维细胞壁厚度减少41.5%，且27.3%的导管出现畸形（图1L-M），首次证明这三个RLK在次生细胞壁沉积中存在协同调控。

这项研究通过技术创新实现了三个重要突破：一是创建了木本植物首例叶源悬浮细胞CRISPR编辑平台，将传统6-8个月的转化周期缩短至3个月；二是建立了"载体池-悬浮细胞"协同的规模化编辑策略，单次实验可产生300+株四重突变体；三是为解析RLK基因家族在木材形成中的功能网络提供了资源宝库。该平台不仅适用于杨树，其技术框架也可推广至其他木本作物，为林木分子设计育种提供了全新研究范式。