基于CRISPRi系统和表观抑制剂AZA的ROS响应性复合物用于PD-L1抑制及肿瘤免疫微环境重塑

本研究针对PD-L1抗体免疫治疗存在的个体差异大、副作用明显等问题，开发了一种ROS响应性聚(β-氨基酯)-AZA(PBAE-S-AZA)复合物，通过CRISPR干扰(CRISPRi)系统靶向下调PD-L1表达，联合DNA甲基转移酶抑制剂AZA增强抗原呈递。该复合物在4T1乳腺癌模型中显著抑制肿瘤生长(抑瘤率83.51%)，提高CD8+T细胞浸润(20.53%)，降低Tregs比例，实现"冷"肿瘤向"热"肿瘤转化，为三阴性乳腺癌联合治疗提供新策略。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法虽然展现出革命性的治疗效果，但临床应用中仍面临三大困境：抗体药物存在明显的个体差异性和免疫相关不良反应(irAEs)；三阴性乳腺癌(TNBC)等"冷肿瘤"因缺乏免疫细胞浸润导致治疗响应率低；表观遗传调控异常造成的肿瘤抗原表达缺失进一步加剧免疫逃逸。如何精准调控PD-L1表达并同时激活肿瘤免疫原性，成为当前研究的重点难点。武汉理工大学化学化工与生命科学学院的Huan Deng、Qianru Li等研究团队在《Materials Today Bio》发表的研究，创新性地将基因编辑技术与表观调控相结合，开发出具有"智能"响应特性的纳米递药系统。

研究主要采用四大关键技术：1) 合成ROS敏感的聚(β-氨基酯)-AZA(PBAE-S-AZA)聚合物，通过¹H NMR和质谱表征；2) 构建靶向PD-L1启动子区的CRISPR/dCas9-KRAB质粒(C_PD-L1)，通过流式细胞术筛选最佳sgRNA；3) 建立3D肿瘤球体模型评估复合物渗透性；4) 使用4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型，通过多色流式分析肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和细胞因子检测评估免疫调节效果。

【合成与表征ROS响应性复合物】研究人员设计了一种含硫醚键的PBAE-S-AZA聚合物，能在高ROS肿瘤细胞内氧化断裂，实现AZA的控释。电镜显示50:1质量比时复合物粒径最小(102.76±0.08 nm)，体外实验证实其在pH5.0或H₂O₂存在时释放速率显著提高。凝胶阻滞实验证明10:1即可完全缩合质粒，而细胞毒性实验显示即使100:1比例下细胞存活率仍>80%。

【CRISPRi系统构建】通过靶向PD-L1基因启动子区的sgRNA3使4T1细胞PD-L1表达降低49.6%。值得注意的是，单独AZA处理对PD-L1表达无显著影响，为联合治疗提供理论基础。

【体外细胞摄取机制】共聚焦显微镜显示Ce6标记的复合物0.5h即可内化，低温(4°C)预处理使摄取降低46.32%，证实能量依赖的内吞途径。硫醚键的ROS清除作用使处理8h后细胞内ROS水平显著低于未修饰组，为基因转染创造有利环境。3D肿瘤球实验显示PBAE-S-AZA/pMax-GFP的渗透深度显著优于PEI25K对照组。

【免疫激活效应】Transwell实验表明，复合物处理组CD80⁺CD86⁺树突状细胞(DC)比例达41.27%，是对照组的1.9倍。转录组分析发现1880个差异基因，MHC I相关基因(H2-K1、H2-Q7等)显著上调，IL-17和TNF信号通路激活。

【体内抗肿瘤效果】局部注射后，复合物在肿瘤部位保留24h，而游离Ce6组迅速清除。治疗组肿瘤体积仅200-300mm³，抑瘤率83.51%，生存期延长(60天存活率66.67%)。免疫荧光显示PD-L1表达显著下调，TUNEL阳性细胞增加。流式分析揭示CD8⁺T细胞浸润达20.53%，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Tregs比例降低，CD8⁺/Tregs比值从0.08提升至1.62。

【肿瘤微环境重塑】复合物治疗使M1型巨噬细胞(CD11b⁺F4/80⁺CD86⁺)比例升至59.23%，促炎因子IFN-γ、IL-12p70水平升高，而免疫抑制因子IL-10下降。引流淋巴结中成熟DC比例达38.53%，证实系统性免疫激活。

该研究创新性地将CRISPRi技术与表观药物递送相结合，突破传统抗体治疗的局限性。通过硫醚键实现ROS响应性释放，既解决AZA水溶性差的问题，又通过清除ROS优化转染微环境。相较于CRISPR-Cas9基因编辑，CRISPRi系统仅抑制PD-L1转录而不切割DNA，安全性更高。研究证实表观调控与基因编辑的协同效应：AZA通过上调MHC I和肿瘤抗原增强免疫识别，而PD-L1下调解除T细胞抑制，双管齐下实现"冷肿瘤"转化。这种模块化设计思路为其他免疫联合治疗提供借鉴，局部给药策略也为实体瘤治疗开辟新途径。未来研究可进一步优化靶向性，探索在深部肿瘤的应用潜力。