基于等温一锅法RPA-CRISPR/Cas12b技术的布鲁氏菌快速高灵敏检测新策略

本研究创新性地开发了等温一锅法重组酶聚合酶扩增(RPA)联合CRISPR/Cas12b系统(IOPR-Cas12b)，靶向布鲁氏菌特异性BCSP31基因保守区，通过实时荧光/侧流层析(LFB)双模式检测，实现40分钟内3.65×101拷贝/反应的高灵敏度，为布病现场筛查提供快速精准的POCT解决方案。

　　

亮点

布鲁氏菌作为兼性胞内病原体，其引起的布病临床表现复杂且非特异性，常导致慢性感染和高复发率。全球动物布病流行严重威胁畜牧业发展，现有检测方法存在耗时长、设备依赖性强等局限。

讨论

本研究突破性整合RPA与CRISPR/Cas12b系统，针对布鲁氏菌BCSP31基因保守区设计gRNA，利用Cas12b的TTN PAM偏好性（较Cas12a的TTTV丰度高3.4倍）和单碱基错配敏感性，开发出首个人畜布病一锅法检测平台。43℃恒温40分钟即可完成检测，灵敏度达3.65×10¹拷贝/反应（荧光法），较传统培养法（24-72小时）和PCR（2-3小时）显著提速。临床验证61例样本与金标准符合率100%，LFB可视化检测摆脱精密仪器束缚，真正实现"样本进-结果出"的现场检测范式。

结论

该平台通过优化RPA引物/gRNA组合与反应体系，首次实现布鲁氏菌核酸扩增与CRISPR检测的单管同步完成，较现有两步骤术（如RPA-Cas12a需90分钟）效率提升125%。其"双模式信号输出"设计既满足实验室精准定量，又适配基层现场筛查，为布病防控提供兼具"快（<1小时）、准（单拷贝）、简（可视化）"三大优势的创新技术路径。