基于代谢糖工程点击化学的补体调节肽涂层高效评估系统：内皮细胞保护新策略

这篇研究开创性地建立了基于代谢糖工程（MGE）和点击化学的内皮细胞补体调节肽（如5C6）涂层评估平台。通过将叠氮糖（Ac4ManNAz/Ac4GalNAz）引入人/猪内皮细胞表面聚糖，实现炔烃标记肽（BCN-5C6）共价连接，证实该涂层可高效招募补体调控因子H（FH），显著抑制补体旁路途径（AP）介导的调理作用（C3b/iC3b沉积）和膜攻击复合物（TCC）形成，为移植相关血栓炎症并发症提供了新型治疗开发工具。

　　

1 引言

补体系统过度激活是器官移植中血栓炎症和缺血再灌注损伤（IRI）的核心机制。当移植物内皮细胞暴露于受体抗体和损伤相关分子模式时，经典途径（CP）、凝集素途径（LP）和旁路途径（AP）相继激活，导致C3b沉积、膜攻击复合物（MAC）形成及过敏毒素释放。尽管全身性补体抑制剂已临床应用，但局部调控更具靶向性。病原体进化出的免疫逃逸策略——通过表面蛋白招募宿主补体调控因子H（FH）来抑制AP放大环路，为治疗设计提供了灵感。然而，直接移植病原体蛋白面临免疫原性挑战，而小分子又难以靶向FH的多结构域特性。

此时，环肽5C6脱颖而出。这种先前鉴定的FH结合肽能特异性识别FH第19-20结构域，在生物材料表面展示时可有效调控补体。但如何将其稳定锚定于活细胞表面仍是难题。本研究巧妙融合两大前沿技术：代谢糖工程（MGE）将非天然叠氮基团（N₃）引入细胞表面聚糖，再通过应变促进的炔烃-叠氮环加成（SPAAC）实现生物正交连接，为肽涂层开发提供了可控平台。

2 结果与讨论

2.1 叠氮糖修饰的兼容性

人微血管内皮细胞（HMEC-1）和猪髂动脉内皮细胞（PIEC）对乙酰化叠氮甘露糖（Ac₄ManNAz）和非乙酰化形式（ManNAz）均表现出优异耐受性，50 μM浓度下细胞活性保持>90%。值得注意的是，猪细胞对叠氮半乳糖（Ac₄GalNAz）的摄取效率更高，暗示物种间糖代谢差异。流式检测DBCO-AF647荧光标记证实，叠氮基团以浓度依赖方式均匀分布于细胞表面，且HMEC-1在25 μM时即达饱和，而PIEC线性范围更广。

2.2 肽涂层的精准构建

荧光显微镜显示，CF标记的BCN-5C6通过点击反应共价连接后，在叠氮修饰的细胞表面形成连续涂层。优化发现2-5 μM肽浓度即可实现有效覆盖，且猪细胞需更低浓度以避免非特异结合。关键的是，涂层分布与叠氮糖修饰水平正相关——50 μM Ac₄GalNAz处理的PIEC呈现最均匀的荧光信号，为功能研究奠定基础。

2.3 FH招募效能验证

使用荧光标记的纯化FH证实，5C6涂层细胞可剂量依赖性捕获FH（EC₅₀≈50 nM），而乱序肽（scr5C6）组无此效应。更令人振奋的是，在50%灭活人血清（iNHS）中，涂层细胞能高效招募内源性FH（血清浓度≈0.3 mg/mL），且招募量与肽密度直接相关。共聚焦成像清晰显示，FH沿细胞膜连续分布，与糖萼修饰模式高度重合。

2.4 动态稳定性解析

时间进程实验揭示，涂层细胞在37°C培养基中保持>30% FH招募活性达150分钟。有趣的是，Cy5标记的5C6荧光信号衰减慢于功能丧失，提示活性降低可能源于FH结合位点遮蔽而非肽脱落。PIEC的GalNAz修饰体系表现出更持久的调控能力，暗示O-糖基化锚定可能比唾液酸修饰更稳定。

2.5 补体抑制功能

在Mg²⁺-EGTA血清（选择性激活AP）中，5C6涂层使PIEC的C3b/iC3b沉积降低60-70%，TCC生成同步抑制。值得注意的是，即使低密度肽涂层也能达到平台效应，说明少量FH即可有效阻断AP放大环路。与完全补体抑制（EDTA处理）相比，残留信号提示该模型可能存在背景干扰，但趋势明确验证了涂层功能。

3 结论

该研究不仅首次实现点击化学介导的内皮细胞补体调节肽定向修饰，更构建了跨物种评估平台。人源HMEC-1适用于自身免疫疾病模型，而猪PIEC在Mg²⁺-EGTA血清中模拟的AP激活则为移植研究提供范式。虽然临床转化需解决糖萼缺氧脱落等问题，但该体系已为优化肽稳定性（如蛋白酶抗性改造）和探索新型锚定策略（如膜融合蛋白）提供了强大工具。未来或可指导转基因猪设计，实现移植物内源性补体调控，突破移植免疫瓶颈。

4 实验方法精要

• 肽合成：采用微波辅助Fmoc固相合成，经H₂O₂氧化环化后，N端偶联BCN-赖氨酸

• 细胞培养：48小时叠氮糖（20-50 μM）预处理，SPAAC反应30分钟（5 μM CF-BCN-5C6）

• 检测体系：流式分析采用APC-抗C3b/iC3b（3E7）和FITC-抗TCC（aE11）抗体

• 统计学：双因素ANOVA分析，显著性阈值α=0.05

这项技术突破犹如为细胞穿上"隐形斗篷"，通过精准操控糖生物学与合成生物学的交叉点，为对抗补体介导的炎症风暴提供了新武器。