靶向RhoA Cys16的共价抑制剂在结直肠癌治疗中的突破性发现

本研究针对结直肠癌(CRC)中RhoA靶点"不可成药"的难题，通过活性蛋白质谱分析(ABPP)筛选发现特异性靶向RhoA亚家族独特半胱氨酸位点Cys16的共价抑制剂CL16。该化合物通过干扰GTP结合和RhoA-GEF相互作用，在体外和体内模型中展现出显著的抗肿瘤和抗转移效果，且无观察毒性，为CRC治疗提供了新策略。

　　

在癌症治疗领域，RhoA长期以来被视为"不可成药"靶点。这个调控细胞骨架和运动的关键分子开关，在结直肠癌(CRC)等多种恶性肿瘤中过度激活，与肿瘤发展和转移密切相关。然而，由于其光滑的球状结构和缺乏明确结合口袋，针对RhoA的药物开发举步维艰。现有策略多集中于其下游效应蛋白如ROCK抑制剂，但无法完全阻断RhoA信号传导。更棘手的是，Rho家族蛋白(RhoA/Rac1/Cdc42)结构高度相似，开发特异性抑制剂面临巨大挑战。

这项发表在《Cell Chemical Biology》的研究开辟了新路径。研究团队将目光投向RhoA亚家族特有的Cys¹⁶位点，该位点邻近核苷酸结合口袋和开关区域，是干预RhoA功能的理想靶点。通过创新的两轮活性蛋白质谱分析(ABPP)筛选策略，研究人员从199个化合物中鉴定出CL16——一个能特异性共价结合RhoA Cys¹⁶而不影响Rac1/Cdc42的小分子。

研究采用了多项关键技术：基于凝胶的ABPP筛选鉴定结合化合物；LC-MS/MS验证靶点结合；FRET生物传感器监测细胞RhoA活性；3D肿瘤球体和多种小鼠模型(异种移植和原位模型)评估抗肿瘤效果；化学蛋白质组学分析靶点特异性。TCGA和GTEx数据库的生物信息学分析为临床相关性提供了支持。

Expressions of RhoA, GEFs, and GAPs correlate with CRC development and/or patient survival

通过分析TCGA数据，发现RhoA在结直肠癌组织中高表达，且晚期患者RhoA通路显著富集。GEFs(如AKAP13)高表达与不良预后相关，而GAPs高表达则预后较好，提示RhoA活性与CRC进展密切相关。

Gel-based ABPP experiment to identify lead compounds targeting RhoA Cys¹⁶

通过两轮ABPP筛选，首先鉴定出能结合RhoA的化合物，再排除与Rac1/Cdc42交叉反应的分子，最终发现CL16对RhoA具有纳摩尔级亲和力(IC₅₀=440 nM)和优异的选择性。

Covalent targeting of RhoA Cys¹⁶ by CL16 perturbed GTP binding onto RhoA and Rho-GEF interactions

LC-MS/MS证实CL16共价修饰RhoA Cys¹⁶。该结合干扰GTP加载，抑制Dbs介导的核苷酸交换，并破坏RhoA与ARHGEF1等GEFs的相互作用。

Inhibition of RhoA activity in CRC cells after CL16 treatment

CL16处理显著降低血清刺激后的RhoA-GTP水平，抑制下游MLC磷酸化，且不影响Rac1/Cdc42活性。FRET生物传感器显示CL16有效抑制细胞RhoA活性。

Anticancer and anti-metastatic effects from CL16 on CRC through RhoA inhibition

CL16通过上调p21/p27诱导G₂期阻滞和凋亡，抑制CRC细胞迁移侵袭。在3D肿瘤球体中，CL16表现出优于Rhosin的生长抑制效果。

Chemical biology and chemoproteomics experiments reveal RhoA as the primary protein target of CL16 in CRC

通过CL16-炔烃探针和竞争实验验证RhoA是主要靶点。化学蛋白质组学显示CL16具有高度靶点特异性，主要修饰RhoA Cys¹⁶。

CL16 exhibits its biological activity in CRC through covalent targeting of RhoA Cys¹⁶

CRISPR-Cas9构建的RhoA C16A突变细胞对CL16无反应，证实其作用完全依赖Cys¹⁶共价结合。

CL16 demonstrated promising in vivo antitumor effects on CRC

在三种CRC异种移植模型和免疫健全的原位模型中，CL16显著抑制肿瘤生长和转移，促进CD3⁺ T细胞浸润，且未观察到毒性。

这项研究具有多重重要意义：首次证实靶向RhoA Cys¹⁶的可行性，突破了该靶点"不可成药"的传统认知；开发的ABPP筛选策略为其他难成药靶点提供了范式；CL16展现出的优异特异性和体内效果使其成为潜在的临床候选药物。特别值得注意的是，CL16不仅能直接杀伤肿瘤细胞，还能改变免疫微环境，这为联合免疫治疗提供了新思路。研究也为理解RhoA在CRC中的精确调控机制提供了新视角，为开发更精准的靶向疗法奠定了基础。