基于nsP4反式互补系统的RNA复制缺陷型甲病毒疫苗研发策略

本研究针对高致病性甲病毒(Alphavirus)疫苗研发受限问题，开发了nsP4基因完全缺失的委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV-△nsP4)，通过构建表达nsP4的BHKnsP4细胞系实现反式互补。该疫苗仅在互补细胞中复制，保持免疫原性同时高度减毒，单剂免疫即可提供完全保护，并成功拓展至基孔肯雅病毒(CHIKV)、西马脑炎病毒(WEEV)和东马脑炎病毒(EEEV)，为风险组3病原体疫苗研发提供了安全高效平台。

　　

在蚊虫肆虐的热带地区，一类名为甲病毒(Alphavirus)的病原体正通过叮咬传播引发重大公共卫生危机。从导致关节剧痛的基孔肯雅病毒(CHIKV)，到致死率高达75%的东马脑炎病毒(EEEV)，这些被列为风险组3的人类病原体，因其高危险性使得传统疫苗研发步履维艰。更棘手的是，现有减毒疫苗存在毒力回复风险，而灭活疫苗又往往免疫效果有限。如何打破这一困局？中国科学院武汉病毒研究所张哲睿团队在《Molecular Therapy》发表的研究给出了创新解决方案。

研究团队采用"去繁就简"的策略，选择委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)作为模式病毒，精准删除其复制必需的非结构蛋白4(nsP4)基因，构建出VEEV-△nsP4突变株。为克服复制缺陷，他们筛选出能稳定表达nsP4的BHK_nsP4细胞系，犹如为病毒装配了"可拆卸的发动机"。这种设计确保疫苗株只能在特定细胞中增殖，从根本上杜绝了环境扩散风险。

关键技术包括：构建nsP4缺失的VEEV-△nsP4基因组，建立BHK_nsP4互补细胞系，通过空斑实验和生长曲线分析病毒复制特性，小鼠模型评估免疫保护效果，并将该策略拓展至CHIKV、WEEV和EEEV等其他甲病毒。

【疫苗株构建与特性分析】

研究证实VEEV-△nsP4在普通细胞中完全丧失复制能力，而在BHK_nsP4细胞中可产生感染性病毒颗粒，且结构蛋白表达水平与野生型相当。电镜观察显示其形态特征完整，证实反式互补系统能有效支持病毒装配。

【安全性与免疫原性评估】

动物实验显示，VEEV-△nsP4对小鼠的致死剂量(LD₅₀)较野生型提高超过6个数量级。单次免疫即可诱导高水平中和抗体，攻毒实验表明免疫组全部存活，而对照组72小时内全部死亡。值得注意的是，疫苗株在体内仅短暂存在3天即被清除，无任何神经侵袭迹象。

【平台普适性验证】

将nsP4缺失策略应用于CHIKV、WEEV和EEEV时，三种疫苗株均展现出与VEEV-△nsP4相似的安全性和免疫效果，证实该技术平台具有广泛的适用性。其中CHIKV-△nsP4诱导的中和抗体效价达到1:1024，显著高于传统灭活疫苗。

这项研究开创性地建立了甲病毒疫苗研发的"双保险"机制：nsP4缺失确保基因组不可复制，而反式互补系统则严格控制病毒增殖环境。相比传统方法，该策略不仅安全性显著提高，且生产成本更低——互补细胞系可规模化培养，而疫苗株无需繁琐的灭活或减毒处理。更重要的是，当新发甲病毒疫情出现时，此平台可快速响应，在6-8周内完成疫苗候选株构建。研究为防控高危病原体提供了可推广的技术范式，其设计理念对开发其他RNA病毒疫苗也具有重要启示意义。