O-GlcNAc糖基化修饰通过基因工程增强NK细胞抗肿瘤免疫活性的机制研究

本研究针对肿瘤微环境(TME)中自然杀伤(NK)细胞功能受损的难题，通过调控O-GlcNAc糖基化修饰（OGT/OGA平衡），结合CRISPR-Cas9基因编辑技术构建OGT-ISS缺失的NK92细胞系。研究发现稳定O-GlcNAcylation水平可显著提升NK细胞对血液瘤和实体瘤的杀伤效能，并克服TME中葡萄糖匮乏、缺氧等抑制因素。该成果发表于《Journal of Advanced Research》，为基于代谢重编程的NK细胞免疫治疗提供了新策略。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，自然杀伤(Natural Killer, NK)细胞因其无需抗原预敏即可杀伤肿瘤的特性备受关注。然而，肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)中的代谢压力和免疫抑制因素常导致NK细胞功能衰竭。其中，O-连接N-乙酰葡糖胺(O-linked N-acetylglucosamine, O-GlcNAc)修饰作为一种动态可逆的蛋白质翻译后修饰(Post-Translational Modification, PTM)，虽在T细胞、B细胞等免疫细胞功能调控中已有研究，但其在NK细胞中的作用仍存争议。韩国生物科学与生物技术研究所(KRIBB)的Se-Chan Oh、Tae-Don Kim团队在《Journal of Advanced Research》发表的研究，通过多维度实验揭示了O-GlcNAcylation增强NK细胞抗肿瘤活性的分子机制，并创新性地采用基因编辑技术构建了具有持续高细胞毒性的工程化NK细胞。

研究团队首先通过液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)和WGA凝集素 pull-down实验鉴定NK细胞中O-GlcNAc修饰的靶蛋白；利用CRISPR-Cas9基因编辑构建OGT内含子剪接沉默区(Intronic Splicing Silencer, ISS)缺失的NK92细胞系；采用流式细胞术、ELISA和实时定量PCR评估细胞表型；建立K562白血病和H460肺癌小鼠模型进行体内疗效验证；通过RNA测序(RNA-seq)分析全转录组变化。

O-GlcNAcylation水平与NK细胞毒性正相关

研究发现IL-2刺激或OGA抑制剂Thiamet G(TG)处理可显著提升NK92细胞和脐带血来源原代NK细胞的O-GlcNAc水平，并增强其对K562、U87MG等肿瘤细胞的杀伤能力。相反，OGT抑制剂OSMI-1则抑制该效应。通过siRNA敲低OGA基因也获得类似结果，证实O-GlcNAcylation与NK细胞功能存在直接关联。

O-GlcNAc修饰靶蛋白的功能网络

质谱分析鉴定出1,577个O-GlcNAc修饰蛋白，其中277个与免疫系统和RNA加工相关。关键蛋白包括已知调控NK功能的NFKB2、KIF5B、JAK3，以及新发现的线粒体RNA结合蛋白LRPPRC。实验证实KIF5B的T405/S950位点和LRPPRC的T112/T1113位点O-GlcNAc修饰对其功能至关重要——突变这些位点会削弱NK细胞毒性，而LRPPRC的修饰还影响其与线粒体RNA的结合能力。

基因工程改造稳定O-GlcNAcylation水平

针对OGT基因的自反馈调节机制（高O-GlcNAc水平会诱导内含子保留转录本增多，从而减少功能性OGT蛋白），研究团队通过CRISPR-Cas9删除OGT-ISS区域，成功构建NK92△OGT-ISS细胞系。该细胞表现出：1）基础O-GlcNAc水平提高2-3倍；2）在IL-2剥夺、葡萄糖匮乏或H₂O₂模拟的缺氧条件下仍能维持修饰水平；3）对血液瘤和实体瘤的体内外杀伤效能显著增强，小鼠生存期明显延长。

转录组学揭示分子机制

RNA-seq分析显示OGT-ISS缺失导致2,073个差异表达基因，包括：1）I型干扰素通路(IFIT1/ISG15/STAT1)上调；2）细胞粘附分子(NCAM2)和驱动蛋白(KIF家族)表达增加；3）TGF-β受体和免疫检查点CTLA4下调。这些变化共同促进NK细胞识别、迁移和效应功能，同时抵抗TME免疫抑制。

该研究首次系统阐明了O-GlcNAcylation通过调控多重分子网络增强NK细胞功能的机制，突破性地采用基因编辑技术克服了代谢干预的时效性局限。所构建的NK92△OGT-ISS细胞系即使在放疗后仍保持较强活性，为临床转化提供新思路。未来研究可进一步探索O-GlcNAc修饰与其他免疫疗法的协同效应，并验证该策略在原发性NK细胞中的应用潜力。这项工作不仅解决了NK细胞治疗中代谢适应性的关键科学问题，也为开发"超级NK细胞"产品奠定了理论基础。