综述：拓扑工程化向导RNA实现CRISPR/Cas活性的可编程控制

这篇综述创新性地提出通过拓扑工程化向导RNA（TE-gRNAs）实现对CRISPR/Cas9/Cas12a/Cas13系统的时空调控。通过构建聚合型、环状或星状RNA拓扑结构，结合光敏基团和化学响应元件，突破传统线性gRNA（guide RNA）在可逆性、均一性和编辑效率上的局限，为合成生物学和基因治疗提供精准可控的基因组编辑工具。

　　

Graphical Abstract

拓扑工程化向导RNA（TE-gRNAs）通过精密的RNA结构设计，为CRISPR/Cas系统装上了"智能开关"。传统线性gRNA的化学修饰常导致编辑效率不稳定且不可逆，而TE-gRNAs采用聚合物、环形或树枝状拓扑结构，在特定位点嵌入光裂解基团（如邻硝基苄基）或化学响应单元（如四氢呋喃可裂解接头），实现了对Cas核酸酶活性的"遥控"操作。示意图显示，星状TE-gRNAs的臂端修饰使Cas9仅在紫外线照射时激活，而环形gRNAs通过内嵌的适体结构可被小分子诱导解旋。

Abstract

CRISPR技术虽革新了基因组编辑，但精准的时空调控仍是瓶颈。TE-gRNAs通过三大创新突破限制：① 明确的拓扑结构（如二聚体gRNA通过三磷酸腺苷响应型接头串联）确保化学反应均一性；② 光/化学双重响应模块实现可逆激活；③ 空间位阻设计降低脱靶效应。在Cas12a系统中，环状TE-gRNAs的硫代磷酸酯修饰使编辑效率提升3倍；而针对Cas13的哑铃型gRNAs，其自折叠茎环结构可被microRNA触发解锁，实现组织特异性RNA编辑。

技术优势

结构稳定性：TE-gRNAs的环状拓扑抗核酸酶降解能力较线性gRNA提升8小时（血清环境测试）。精准调控：光响应型TE-gRNAs在405nm激光照射下，10分钟内即可激活Cas9，关闭速度达毫秒级。多功能性：聚乙二醇修饰的树突状gRNAs可同时负载4种不同靶向序列，实现多重基因编辑。实验数据显示，针对HEK293T细胞的EMX1位点，星状TE-gRNAs将脱靶率控制在0.05%以下。

应用前景

在疾病治疗中，线粒体靶向的环状TE-gRNAs通过膜电位响应型开关，选择性修复mtDNA突变；而血脑屏障穿透型TE-gRNAs采用葡萄糖酸修饰，在帕金森病小鼠模型中实现多巴胺神经元特异性编辑。合成生物学领域，TE-gRNAs与生物传感器联用，构建了环境污染物响应的基因回路，其诱导倍数超过1000倍。

挑战与展望

当前TE-gRNAs面临化学合成产率低（环化效率约35%）、体内递送效率待优化等问题。未来发展方向包括开发近红外光响应型酞菁修饰gRNAs，以及利用DNA折纸技术构建纳米级gRNA阵列。通过机器学习预测最优拓扑结构，或将使TE-gRNAs成为"智能基因手术刀"的终极形态。