γδ T细胞来源的可溶性Sema4D通过Plexin-B/mTOR信号通路抑制成骨细胞分化在双膦酸盐相关性颌骨坏死中的作用机制及靶向治疗研究

这篇研究揭示了双膦酸盐相关性颌骨坏死（BRONJ）的新机制：γδ T细胞通过基质金属蛋白酶3（MMP3）剪切膜结合型Sema4D（mSema4D）产生可溶性Sema4D（sSema4D），后者通过Plexin-B1/2-mTOR信号通路抑制成骨细胞分化。研究创新性开发了负载抗Sema4D抗体的复合水凝胶（Gel-BG@ab），实现了sSema4D的靶向中和和局部缓释，为BRONJ的免疫-材料联合治疗提供了新策略。

　　

3.1 BRONJ病灶中γδ T细胞浸润增加

通过建立野生型（WT）和TCRδ^-/-小鼠的BRONJ模型，研究发现唑来膦酸（ZOL）处理组小鼠出现明显的颌骨坏死、新骨形成减少和炎症细胞浸润。基因集富集分析（GSEA）显示成骨细胞分化通路显著下调，而γδ T细胞在BRONJ病灶中的比例较对照组增加2.6倍（11.32% vs. 4.34%），免疫荧光染色进一步证实其特异性富集。

3.2 γδ T细胞通过抑制成骨分化促进BRONJ发生

γδ T细胞缺陷的TCRδ^-/-小鼠在ZOL处理后BRONJ发病率显著降低（25% vs. 87.5%），微CT显示其骨体积分数（BV/TV）和骨密度（BMD）明显改善。组织学分析显示TCRδ^-/-小鼠的蓝色胶原沉积和osterix阳性细胞数量显著增加，证实γδ T细胞通过抑制成骨功能参与BRONJ进展。

3.3 γδ T细胞来源的Sema4D是关键效应分子

转录组分析发现TCRδ^-/-小鼠病灶中Sema4D mRNA水平显著降低。ELISA和流式检测显示，γδ T细胞缺失导致可溶性Sema4D（sSema4D）和膜结合型Sema4D（mSema4D）⁺CD3⁺ T细胞数量减少，免疫荧光证实Sema4D与CD3⁺ T细胞共定位。

3.4 活化γδ T细胞的sSema4D体外抑制成骨分化

ZOL以剂量依赖方式促进γδ T细胞增殖（15μM处理6天纯度达77.93%），同时降低mSema4D表达但增加培养上清中sSema4D浓度。成骨细胞与γδ T细胞上清共培养后，ALP活性和Runx2表达显著降低，而抗Sema4D抗体（αSema4D）可逆转此抑制效应。

3.5 sSema4D通过Plexin-B/mTOR通路发挥作用

STRING数据库预测Plexin-B1/2与mTOR存在相互作用，分子对接显示其结合能达-16.1 kcal/mol。siRNA敲低Plexin-B1/2或使用mTOR抑制剂雷帕霉素均可阻断sSema4D对ALP的抑制，Western blot证实该通路调控成骨标志物ALP和OCN的表达。

3.6 MMP3介导γδ T细胞mSema4D剪切

KEGG分析显示基质金属蛋白酶通路显著富集。ZOL长期刺激选择性地维持γδ T细胞中MMP3高表达（较基线增加3.2倍），MMP抑制剂GM6001（100nM）可使mSema4D保留率提高58%，证实MMP3是sSema4D生成的关键酶。

3.7 复合水凝胶Gel-BG@ab的构建与特性

通过将介孔生物活性玻璃（BG）与抗Sema4D抗体结合后嵌入PLGA-PEG-PLGA（PPP）水凝胶，制备的Gel-BG@ab具有缓释特性（21天降解率>90%）。XPS检测到BG@ab中的硫（S）和氮（N）元素，证实抗体成功负载，且材料对成骨细胞活力无影响。

3.8 Gel-BG@ab治疗显著改善BRONJ

大鼠模型中，Gel-BG@ab治疗组黏膜愈合率100%，微CT显示其BV/TV较对照组提高2.1倍。组织学分析显示坏死骨面积减少67%，osterix⁺细胞数量增加3.8倍，证实该策略可有效阻断Sema4D-Plexin-B/mTOR致病循环。

这项研究首次阐明γδ T细胞-MMP3-Sema4D-Plexin-B/mTOR轴在BRONJ中的作用，开发的免疫调节性水凝胶为骨免疫微环境调控提供了新材料范式。