大豆种子脂肪酸积累的负调控因子GmERFA与GmNFYA互作机制及其育种应用价值

本研究通过RNA-seq分析和酵母双杂交筛选，发现AP2/ERF型转录因子GmERFA作为大豆种子脂肪酸（FA）积累的负调控因子，与正调控因子GmNFYA互作，抑制下游基因GmbZIP123和GmZF392的表达，形成GmERFA-GmNFYA-GmbZIP123/GmZF392调控网络。CRISPR敲除GmERFA显著提升种子含油量，而自然变异分析揭示Hap3单倍型与低表达、高含油量相关，为高油大豆育种提供新靶点。

　　

1 引言

大豆作为全球最重要的油料作物之一，其种子含油量直接影响经济价值和工业应用。然而，大豆油脂积累的调控机制尚未完全阐明。本研究通过转录组分析和蛋白质互作筛选，发现AP2/ERF家族转录因子GmERFA在种子发育后期发挥"刹车"作用，与正调控因子GmNFYA互作，形成动态平衡网络调控油脂积累。

2 结果

2.1 GmERFA的鉴定与功能特征

GmERFA（Glyma.02G016100）编码含AP2结构域的300个氨基酸蛋白，在低油大豆品种中高表达。亚细胞定位显示其定位于细胞核，具有转录抑制活性。过表达GmERFA导致拟南芥和大豆种子变小、含油量降低（降幅达5.4%），而蛋白含量显著增加（4.4%-4.5%）。

2.2 基因编辑验证调控功能

利用CRISPR/Cas9构建gmerfa/b双敲除突变体，种子含油量提升4.4%-5.4%，百粒重增加5.3%-8.8%。相反，gmnfya/a'突变体含油量下降，证实GmNFYA的正调控作用。

2.3 分子互作机制解析

酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）证实GmERFA与GmNFYA直接互作。EMSA和ChIP-qPCR显示：

1. 1.

   GmERFA直接结合GmbZIP123启动子的TTG/GCC-box元件

2. 2.

   抑制GmNFYA对GmbZIP123和GmZF392的转录激活

3. 3.

   双重调控模式：既直接抑制启动子活性，又通过蛋白互作阻断GmNFYA功能

2.4 碳源供应调控

GmERFA通过抑制糖转运基因（GmSWEET10a/b）和糖酵解基因（GmENO2）表达，减少脂肪酸合成前体供应。gmerfa/b突变体可溶性糖含量提升10.4%-40.1%，印证其对碳代谢的调控作用。

2.5 自然变异与育种应用

分析341份大豆种质发现：

• •

  野生型中Hap1单倍型（64.9%）与高表达、低含油量相关

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  栽培型中Hap3单倍型（占比优势）启动子活性降低，含油量提高10.34%

• •

  Tajima's D值表明GmERFA在驯化过程中受到选择

3 讨论

该研究揭示了大豆种子发育晚期油脂积累的终止机制：GmERFA通过"直接抑制+干扰激活"双重模式，与GmNFYA形成动态平衡网络。Hap3单倍型的发现为分子设计育种提供重要标记，通过编辑GmERFA或其启动子区域，可协同提高含油量和种子重量。研究建立的GmERFA-GmNFYA-GmZF392/GmbZIP123调控模块，为作物油脂代谢研究提供新范式。

4 材料与方法

实验体系涵盖：

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  转基因材料构建（农杆菌介导大豆转化）

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  互作验证（Y2H/Split-LUC/Co-IP）

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  代谢检测（GC分析脂肪酸，TBA法测糖含量）

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  表型分析（种子性状自动化测量平台）

该工作由中国农业科学院团队完成，获国家重点研发计划（2021YFF1000104）和国家自然科学基金（32090062）资助。