细胞依赖性准包膜化戊型肝炎病毒释放机制：揭示pORF3缺失条件下高尔基体相关的新型病毒逸出途径

这篇研究揭示了戊型肝炎病毒(HEV)在pORF3缺失条件下仍能通过高尔基体相关途径实现准包膜化(eHEV)释放的突破性发现。通过比较PLC/PRF/5（肝癌）和A549/D3（肺癌）细胞系，研究团队首次证实HEV存在不依赖多泡体(MVB)/ESCRT通路的替代释放机制，该发现为理解HEV细胞嗜性差异和开发靶向病毒逸出的抗病毒策略提供了全新视角。

　　

背景

戊型肝炎病毒(HEV)作为全球急性病毒性肝炎的主要病原体，其独特的准包膜化(eHEV)释放机制长期被认为完全依赖病毒辅助蛋白pORF3介导的多泡体(MVB)途径。然而，不同细胞系中该过程的特异性仍存在认知空白。

方法

研究团队构建了pORF3缺陷型HEV基因3c型突变体(HEVΔORF3)，在肝癌细胞PLC/PRF/5和肺癌细胞A549/D3中系统比较了野生型(HEVwt)与突变体的释放特征。通过密度梯度离心、免疫电镜、共聚焦显微术等技术，全面解析了病毒颗粒的包膜状态、释放动力学及亚细胞定位。

结果

3.1 ORF3缺陷型HEV在PLC/PRF/5细胞中保持感染性

令人惊讶的是，HEVΔORF3在PLC/PRF/5细胞中展现出与野生型相当的复制效率，细胞上清病毒RNA载量高达10⁸-10⁹拷贝/mL。尽管相对感染性降低约5倍（4.3×10³ vs 8.8×10² RNA拷贝/FFU），免疫荧光显示pORF2从点状结构转变为纤维状分布。

3.2 HEVΔORF3颗粒保留抗中和特性

中和实验揭示，未经脱氧胆酸钠(NaDoC)处理的HEVΔORF3颗粒仍能抵抗抗pORF2抗体的中和作用，暗示其包膜完整性。这种抗性在NaDoC处理后消失，与典型eHEV行为一致。

3.3 密度梯度与电镜验证准包膜保留

等密度离心显示HEVΔORF3颗粒具有1.17 g/mL的eHEV特征密度，经NaDoC处理后迁移至1.24 g/mL（裸核衣壳密度）。免疫电镜证实处理前pORF2抗体无法标记包埋的衣壳，处理后则出现明显标记。

3.4 pORF2亚细胞定位重编程

共聚焦显微分析揭示关键发现：在PLC/PRF/5细胞中，HEVΔORF3的pORF2与MVB标志物CD63共定位显著减少，而与反式高尔基网络(TGN)标志物TGN46共定位增加3倍。这种重定位在A549/D3细胞中完全相反，且后者TGN呈现囊泡状而非纤维状结构。

3.5 高尔基体依赖性释放途径

Western blot显示HEVΔORF3颗粒中TGN46含量显著增加，且该蛋白与病毒衣壳共迁移。在PLC/PRF/5细胞中，TGN46信号随NaDoC处理发生与pORF2平行的密度偏移，强烈提示高尔基体来源的膜成分参与包膜形成。

讨论

这项研究颠覆了"pORF3-ESCRT通路是HEV准包膜化唯一途径"的传统认知。PLC/PRF/5细胞独特的纤维状TGN结构可能通过以下机制补偿pORF3缺失：

1. 1.

   pORF2固有倾向与TGN适配体蛋白AP-1等宿主因子相互作用

2. 2.

   HBV表面抗原(HBsAg)表达诱导的高尔基体重构创造有利微环境

3. 3.

   极化细胞的定向分泌能力促进非经典释放

该发现对HEV防控具有多重启示：临床分离株中自然存在的ORF3缺失突变可能通过替代途径维持传播；靶向pORF3的抗病毒策略需重新评估；不同组织来源的eHEV可能具有异质性膜组成，影响致病机制。未来研究需阐明高尔基体相关释放的具体分子机制及其在自然感染中的相关性。