高稳定性Cas9通过拮抗HSC70介导的降解途径增强HBV基因组清除能力

本文揭示了CRISPR/Cas9系统中Cas9蛋白在人体细胞内的降解机制，发现其通过分子伴侣HSC70介导的分子伴侣介导的自噬（CMA）-溶酶体途径被降解。研究通过突变Cas9蛋白中的KFERQ样基序（aa 670-674和894-898），开发出高稳定性Cas9（HSCas9），显著增强了对持续复制的乙型肝炎病毒（HBV）基因组的破坏能力，为抗病毒治疗提供了新策略。

　　

Cas9蛋白的降解机制与CMA-溶酶体途径

研究发现，Cas9蛋白在人体细胞中主要通过分子伴侣HSC70介导的CMA-溶酶体途径降解。通过抑制剂实验（如BafA1抑制溶酶体活性）和激活剂（如AR7上调LAMP2A表达）验证了这一途径的关键作用。Co-IP和免疫荧光证实Cas9与HSC70、LAMP2A存在结合与共定位，而Cas9蛋白序列中的4个KFERQ样基序（如IRDKQ、QRKFD）是HSC70识别的关键位点。

HSCas9的设计与稳定性提升

通过定点突变技术构建了KFERQ样基序突变的Cas9变体（Cas9M1、Cas9M3），其中双突变体HSCas9（IRDKQ和QRKFD突变）稳定性显著提高。实验显示，HSCas9与HSC70的结合能力几乎消失，且在HSC70过表达或饥饿诱导CMA时仍保持稳定。竞争性实验表明，ESCRT-0组分HRS可通过与HSC70竞争结合Cas9，抑制其CMA降解，进一步验证了降解机制。

HSCas9增强HBV基因组破坏能力

在体外实验中，HSCas9/gRNA系统对HBV基因组（包括cccDNA）的切割效率显著高于野生型Cas9，表现为HBsAg、HBeAg和HBc水平显著降低，且PCR和测序证实短片段HBV基因组比例增加。在HBV感染模型中，稳定表达HSCas9的HepG2-NTCP细胞对病毒复制的抑制效果更强，且Southern blot显示cccDNA水平显著下降。

安全性与应用潜力

全基因组测序和免疫分析表明，HSCas9未增加脱靶效应或肝毒性（ALT/AST水平正常）。研究还发现，HSCas9的编辑效率优势在Cre/loxP重组cccDNA系统和体内小鼠模型中均得到验证。此外，该策略可拓展至其他Cas蛋白（如SaCas9、Cas12a），为基因编辑和核酸检测工具的优化提供新思路。

总结与展望

本研究阐明了CMA途径对CRISPR/Cas9系统抗病毒效能的限制，提出通过靶向Cas9降解通路增强其稳定性的治疗策略。HSCas9为清除HBV等持续复制的病毒基因组提供了更优工具，同时为基因编辑技术的安全性和效率优化开辟了新方向。