TBX2亚家族与Egr1在Ras驱动肺腺癌中的多效性调控机制及免疫微环境重塑研究

本研究通过首创的多重CRISPRko小鼠模型结合TuBa-seq技术，系统解析了TBX2亚家族(Tbx2/3/4/5)及其效应基因(Egr1/Chd2/Tnfaip3/Atf3)在KRASG12D驱动肺腺癌(LUAD)中的动态作用。发现Egr1缺失通过免疫失调（T细胞耗竭标志物PD-1/CTLA4上调）促进肿瘤进展，其促瘤效果超越经典抑癌基因Rb1缺失，为LUAD免疫治疗提供新靶点。

　　

肺腺癌(LUAD)作为肺癌主要亚型，其发生发展涉及复杂的遗传和表观遗传改变。TBX2转录因子亚家族(Tbx2/3/4/5)在肺发育中起关键作用，但它们在LUAD中通过表观沉默下调的现象，究竟是肿瘤进展的驱动因素还是伴随事件，始终存在争议。更棘手的是，这些基因在不同癌症中表现出"双面性"——既能抑制肿瘤又可促进发展，这种高度环境依赖的特性使得传统细胞实验难以揭示其真实功能。与此同时，KRAS突变作为LUAD最常见驱动突变，其与TBX2信号网络的交互机制更是空白领域。

为解决这些难题，Athar Khalil团队开发了突破性的多重遗传学模型。通过将KRAS^LSL-G12D小鼠与Rosa26^{CAG-LSL-Cas9-GFP}小鼠杂交，创建了可同时进行多基因编辑的KC模型系统。研究人员采用肿瘤条形码测序技术(TuBa-seq)——这种高通量谱系追踪方法，将靶向TBX2亚家族及其关联基因(Egr1/Chd2/Tnfaip3/Atf3)的sgRNA与独特条形码整合到慢病毒载体，通过气管灌注诱导肿瘤。在6周和20周两个时间点，利用深度测序(平均>10⁷ reads/样本)定量分析各基因缺失对肿瘤发生、发展的影响，并结合转录组学和免疫组化解析机制。

Development of the first in vivo lung cancer model of TBX2 subfamily signaling-associated genes using multiplexed CRISPRko and lineage-tracing

研究成功构建了首个TBX2亚家族多重敲除的LUAD模型。荧光显微镜和TTF-1染色证实，KRAS^G12D与不同基因缺失组合可诱导从增生性病变到恶性肿瘤的连续谱系，为后续分析奠定基础。

Multiplexed quantification of TBX2 gene function in Kras-driven lung tumors

TuBa-seq定量揭示：① Chd2缺失抑制肿瘤起始和进展；② Tnfaip3缺失促进早期增殖；③ Tbx2呈现阶段特异性作用——抑制早期生长但促进晚期进展；④ Egr1缺失表现最强促瘤效应，20周时肿瘤体积增加5倍(P<0.05)，超越Rb1缺失效果。这种多维度生长表型的精确量化，凸显了TuBa-seq在解析基因动态功能中的独特优势。

Immune pathway modulation and tumor progression following Egr1 suppression in Kras-driven lung cancer

机制研究发现：① Egr1缺失肿瘤中421个差异表达基因显著富集于免疫通路(IL-17信号、干扰素响应等)；② 免疫组化显示CD4⁺/CD8⁺ T细胞浸润增加，但伴随PD-1/LAG-3等耗竭标志物上调；③ 关键枢纽基因分析鉴定出12个核心调控因子(如Cxcl5/Cxcl13)，构成免疫调控网络；④ 值得注意的是，DepMap数据库显示EGR1敲除对KRAS突变肺癌细胞系增殖无影响，提示其抑瘤作用依赖于免疫微环境调控。

这项研究的意义在于：首次在体内证实TBX2亚家族成员及其效应基因在LUAD中的因果作用，特别是发现Egr1通过调节T细胞功能发挥强效抑瘤效应。该发现突破了传统"癌基因/抑癌基因"二分法的认知局限，揭示了表观遗传失调基因如何通过免疫编辑促进肿瘤进展。技术层面，建立的TuBa-seq多重分析体系为研究基因互作提供了新范式。临床转化方面，EGR1相关免疫特征可作为LUAD免疫治疗疗效预测标志物，而其调控的趋化因子网络(CXCL5/CXCL13等)为开发联合治疗策略指明方向。

论文发表于《Genes》的这项工作，不仅填补了TBX2信号网络在肺癌中的功能空白，更开创性地将CRISPR筛选、谱系追踪和免疫微环境分析相结合，为复杂肿瘤生态系统研究树立了新标杆。未来通过单细胞测序解析Egr1缺失如何特异性影响T细胞状态，或将揭开肿瘤免疫逃逸的更精细调控机制。