深度学习引导的大肠杆菌核心启动子可编程设计：从序列架构到强度调控

本研究针对大肠杆菌核心启动子（core promoter）强度预测与设计的难题，开发了整合突变-条形码-反向测序（MBRS）技术的高通量平台，构建了包含112,955个变体的合成启动子库，并基于Transformer模型（R=0.87）和条件扩散模型实现了启动子强度的精准预测（R=0.95）与从头设计。该工作为合成生物学提供了模块化、可扩展的转录调控工具，相关平台已开源（www.yudenglab.com）。

　　

基因表达调控是合成生物学的核心挑战，而启动子作为转录起始的"开关"，其强度控制直接决定代谢通路的效率。尽管大肠杆菌σ⁷⁰型启动子的-10/-35框（box）和间隔区（spacer）特征已被解析，但传统方法难以预测其非线性序列-功能关系。现有机器学习模型存在泛化性差、数据集局限等问题，而随机突变库又面临冗余度高、功能覆盖率低的困境。

为解决这些难题，江南大学Zhou Xuan等开发了闭环工作流程：首先通过突变-条形码-反向测序（MBRS）技术构建包含112,955个变体的合成启动子库，覆盖16,226倍表达范围。分析发现保守区（-10/-35框）通过RNA聚合酶（RNAP）结合能主导强度变异（贡献率50.25%），而间隔区通过DNA刚性（46-51 nm最优）实现精细调控。基于此，研究团队建立了Transformer预测模型（Pearson R=0.87），其注意力机制（attention mechanism）揭示间隔区对强度调控的关键作用。

关键技术包括：

1. 1.

   MBRS技术组合设计-35框（252种）、-10框（117种）和随机化间隔区，通过条形码关联mRNA/DNA测序数据

2. 2.

   构建pSC101质粒系统，采用RiboJ绝缘子和BCD2 RBS（核糖体结合位点）稳定表达

3. 3.

   条件扩散模型（conditional diffusion model）按8个强度等级生成新启动子，结合Transformer反向筛选

主要结果：

1. 1.

   质粒系统优化

   通过引入RiboJ绝缘子和标准BCD2 RBS，将表达变异系数降至0.065。采用PL308启动子控制RFP内参，实现稳定表达（CV=0.046）。

2. 2.

   区域功能解析

   -10/-35框组合主导强度变化（ANOVA P<0.01），其RNAP结合能与强度呈负相关（R=-0.75）。间隔区刚性分析显示46-51 nm区域富集于高活性启动子。

3. 3.

   生成模型验证

   条件扩散模型生成启动子的实测强度与目标强度相关性达0.93，显著优于WGAN-GP模型。Transformer预测生成序列的强度R值达0.95。

4. 4.

   应用验证

   设计的8个梯度强度启动子（P1-P8）在6种侧翼序列中保持强度等级（R=0.93）。中强度启动子（P4-P6）优化葡萄糖酸诱导系统，使泄漏表达降低同时动态范围提升3倍。

该研究首次实现大肠杆菌核心启动子的端到端设计，其模块化平台可扩展至其他调控元件（如UP元件、TFBS）。通过揭示保守区与间隔区的协同调控机制，为合成生物学提供了精准转录调控工具。值得注意的是，条件扩散模型展现出超越训练数据的设计能力，生成的启动子强度分布更均衡（28.6%强度>2.5 vs 原始库15.3%）。研究建立的www.yudenglab.com平台已实现设计-预测-验证闭环，相关方法发表于《Nucleic Acids Research》。