果蝇体色多样性的分子基础：冗余与单一顺式调控元件在快速演化中的关键作用

本研究针对动物表型多样性的分子机制，以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)性别二态性体色为模型，系统解析了顺式调控元件(CREs)在基因调控网络(GRN)演化中的双重作用。通过SCRMshaw预测结合转基因验证，发现转录因子基因hth、grh和Eip74EF存在2-10个功能冗余的CREs，其活性在单态与二态物种间高度保守；而实现基因如yellow、tan等则受单一非冗余CREs调控。研究表明GRN演化可能偏好作用于非冗余调控架构的基因，为理解性状快速演化提供了新视角。

　　

动物表型多样性的产生机制是进化发育生物学的核心问题。黑腹果蝇(D. melanogaster)腹部体色呈现显著的性别二态性——雄性A5-A6节段具有完全黑色 tergite（背板），而雌性仅在后部呈现条纹状黑色，这种特征从单态祖先状态演化而来。虽然已知该性状涉及复杂的基因调控网络(GRN)，但顺式调控元件(CREs)的架构如何影响演化路径仍不清楚。传统观点认为模块化CREs（单一功能元件）是性状演化的主要驱动力，但越来越多证据显示冗余CREs（多个功能重叠元件）广泛存在，这为理解GRN演化带来了新的复杂性。

为解析这一问题，Williams团队以果蝇体色GRN为模型，通过计算预测与实验验证相结合的策略展开研究。利用SCRMshaw工具对16个已知腹部CREs进行训练后，从基因组中筛选出29个候选序列(S3.1-S3.29)，聚焦于调控基因（如转录因子）的潜在CREs。通过核定位绿色荧光蛋白(neGFP)报告系统、CRISPR/Cas9基因编辑、种间比较等技术，系统评估了这些CREs的功能与演化特征。

关键技术包括：1) SCRMshaw算法预测CREs；2) 转基因果蝇neGFP报告系统验证时空表达模式；3) CRISPR/Cas9构建hth^ΔS3.11和hth^ΔS3.14缺失突变体；4) 免疫组化分析Hth蛋白表达；5) RNA干扰(RNAi)敲降Eip74EF；6) 跨物种比较D. melanogaster、D. auraria、D. malerkotliana和D. willistoni的CRE功能保守性。

Identification of Novel CREs for Eight Trans-regulators

研究发现12/19预测序列具有蛹期腹部表皮增强子活性。引人注目的是，grainy head(grh)基因内含子区的4个CREs(S3.7-S3.10)均驱动单态性neGFP表达（图2），而homothorax(hth)基因座的S3.11和S3.14分别在前部节段(A2-A4)和全腹部激活表达（图3）。CRISPR删除实验显示，hth^ΔS3.14纯合子出现不完全外显的异位黑色素沉积（图4），证实这些CREs对体色抑制功能不可或缺，但表型弱于hth RNAi，暗示存在其他冗余调控元件。

homothorax Expression and its Regulation Predate the Origin

免疫组化揭示Hth在75 hAPF（蛹形成后小时数）广泛表达于所有腹部节段，该模式在二态(D. auraria、D. malerkotliana)和单态(D. willistoni)物种间高度保守（图5）。种间CRE报告实验表明，hth S3.11/S3.14在willistoni中活性降低但功能保留（图6），序列比对显示这些CREs在二态物种谱系中经历了功能强化。

The Highly Redundant Regulation of the Eip74EF

Eip74EF位点的10个预测CREs(S3.20-S3.29)全部显示腹部表皮增强子活性（图7），创下单基因CREs数量的新记录。RNAi实验首次证实Eip74EF是黑色素形成的广谱抑制因子。令人惊讶的是，D. willistoni的10个同源序列均保留增强子功能（图8），暗示这种高度冗余架构在3000万年前就已存在。

讨论与意义

研究揭示了GRN演化的"双轨制"模式：实现基因(如yellow、tan)和部分调控基因(如bab)通过单一CREs的模块化改变驱动表型创新；而核心调控基因(如hth、Eip74EF)则通过冗余CREs维持表达稳定性。这种架构差异可能解释为何某些基因更易成为演化"热点"。该发现为理解性状快速演化提供了分子框架，对揭示动物多样性产生的普遍规律具有启示意义。论文发表于《Molecular Biology and Evolution》，为顺式调控演化研究树立了新范式。