基于杜氏盐藻外泌体样纳米囊泡的PD-L1抗体与miR-375序贯共递送系统增强食管癌基因/免疫联合治疗

针对食管癌治疗中天然外泌体规模化制备难、靶向性不足的问题，研究人员利用海洋单细胞藻类杜氏盐藻（Dunaliella salina）开发了外泌体样纳米囊泡（DENV）载体系统，通过cRGD肽修饰实现靶向递送，并负载miR-375与aPD-L1。该体系在基质金属蛋白酶（MMP-2）响应下实现序贯释放，显著抑制KYSE-150细胞增殖迁移，并通过调控YWHAZ基因增强抗肿瘤效果，为规模化生产功能性纳米载体提供了新策略。

　　

食管癌作为高恶性消化道肿瘤，传统治疗面临药物递送效率低、免疫抑制微环境等挑战。外泌体虽被誉为“特洛伊木马”载体，但哺乳动物来源的外泌体存在产量低、成本高、内容物不可控等瓶颈。而植物源外泌体样囊泡虽产量高，却缺乏肿瘤靶向能力。如何开发兼具规模化生产潜力与精准靶向功能的纳米载体，成为突破肿瘤治疗困境的关键。

这项发表于《Non-coding RNA Research》的研究创新性地选择了海洋单细胞藻类杜氏盐藻（Dunaliella salina）作为“生物反应器”。这种无细胞壁的嗜盐真核藻类生长快速、培养成本低廉，其分泌的外泌体样纳米囊泡（DENV）直径约60 nm，每100 mL培养上清可提取1.2×10¹¹颗粒。研究团队通过化学偶联将靶向肽c(RGDyK)修饰于DENV表面，形成能特异性识别肿瘤细胞α_vβ₃整合素受体的cRGD-DENV，并利用电穿孔法装载肿瘤抑制miR-375。更巧妙的是，通过MMP-2敏感肽Gly-PLGLAG-Cys将aPD-L1偶联在囊泡表面，构建出能响应肿瘤微环境（TME）的智能递送系统cRGD-DENV-aPD-L1/miR-375。

关键技术包括：1）多步差速离心法从杜氏盐藻培养液中分离DENV；2）荧光共定位验证cRGD修饰效率；3）透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）表征纳米颗粒形态；4）MMP-2触发释放实验；5）KYSE-150细胞移植瘤模型评估体内靶向性；6）流式细胞术检测细胞凋亡；7）Western blot分析YWHAZ蛋白表达。

研究结果部分：

1. 1.

   载体构建与表征

   TEM显示DENV呈典型“圆盘”状，粒径约60 nm，修饰后增至150 nm。体外释放实验证实，MMP-2存在时8小时内aPD-L1释放率达90%，而正常生理条件下仅少量释放。

2. 2.

   靶向性与穿透能力

   cRGD修饰使DENV在KYSE-150细胞中的摄取量提升2倍，且能深度穿透肿瘤球体（60 μm层扫仍保持信号）。活体成像显示，静脉注射12小时后cRGD-DENV在肿瘤部位富集，而普通DENV主要滞留于肝脏。

3. 3.

   协同抗肿瘤效应

   联合治疗组（cRGD-DENV-aPD-L1/miR-375）使细胞凋亡率升至31.09%，显著高于单药组（13.6%-22.7%）。伤口愈合实验显示48小时后仍保留50%划痕间隙，Transwell显示侵袭细胞数减少70%。机制上，miR-375通过下调致癌基因YWHAZ抑制肿瘤进展，而aPD-L1阻断PD-1/PD-L1通路激活T细胞（CD8⁺T细胞浸润增加3倍）。

4. 4.

   体内安全验证

   治疗组小鼠主要器官无病理损伤，血清ALT、AST等肝肾功能指标正常，IL-6等炎症因子未升高，证实该系统具有良好的生物相容性。

结论部分强调，该研究首次将海洋藻类外泌体应用于肿瘤联合治疗，其创新性体现在：1）突破哺乳动物外泌体的产能限制，建立低成本（海水培养）、高产量的纳米载体平台；2）通过cRGD-MMP-2双重靶向策略实现“肿瘤定位-微环境响应-序贯释放”的精准递送；3）基因治疗（miR-375）与免疫治疗（aPD-L1）的协同作用使肿瘤体积缩小60%。这种源自天然生物材料的工程化囊泡，为临床转化提供了兼具规模化生产潜力与治疗效能的解决方案。