基于CRISPR-Cas13a侧流层析技术的中国囊状幼虫病病毒快速检测方法开发

为解决中国蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)传统检测方法依赖专业设备和人员的问题，研究人员开发了一种基于CRISPR-Cas13a和重组酶辅助扩增(RAA)的侧流层析检测(LFD)技术。该技术可在1小时内完成检测，灵敏度达2.80×101 copies/μL，与qPCR结果一致性达100%，为蜂业现场检测提供了高效解决方案。

　　

中国蜜蜂产业正面临一个隐形杀手的威胁——中国囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus, CSBV)。这种病毒专门感染中华蜜蜂(Apis cerana)，能导致幼虫大规模死亡和蜂群崩溃。自1972年首次发现以来，CSBV已在中国南北多地暴发流行，严重威胁着作为重要授粉昆虫的蜜蜂种群。然而，现有的电子显微镜观察和实时荧光定量PCR检测方法存在设备依赖性强、操作复杂、成本高等问题，难以在养蜂场等现场环境中推广应用。面对这一困境，华中农业大学的研究团队在《Animal Diseases》上发表了一项突破性研究，开发出了一种基于CRISPR-Cas13a的侧流层析快速检测技术。

研究团队采用了三项关键技术：首先基于CSBV保守的VP2基因设计重组酶辅助扩增(RAA)引物和crRNA；其次建立CRISPR-Cas13a与侧流层析检测(LFD)的联合系统；最后使用湖北地区采集的100份临床样本进行验证。通过优化反应体系，实现了从核酸提取到结果判读的全流程快速检测。

在结果部分，研究取得了多项重要发现：

1. 1.

   RAA反应优化：通过毛细管电泳验证，三组引物均能有效扩增目标片段，其中引物2扩增效率最高(3.07 ng/μL)。

2. 2.

   检测方法建立：成功构建了基于FAM-生物素双标记报告探针的LFD系统，通过金标抗体实现可视化检测。

3. 3.

   灵敏度测试：最优组合(引物2+crRNA2)的检测限达2.80×10¹ copies/μL，较传统方法提高1-3个数量级。

4. 4.

   特异性验证：与BQCV、DWV等四种蜜蜂病毒无交叉反应，显示高度特异性。

5. 5.

   临床验证：100份样本检测结果与qPCR完全一致，阳性检出率58%，重复实验显示良好稳定性。

讨论部分指出，这项研究首次将CRISPR-Cas13a技术应用于昆虫病毒检测领域。相比传统PCR需要1天时间，新方法仅需40分钟恒温反应即可完成检测，且结果肉眼可见。特别值得注意的是，该方法在灵敏度(2.80×10¹ copies/μL)方面显著优于已报道的TaqMan PCR(5.00×10¹ copies/μL)和ELISA(3.67×10⁴ copies/μL)方法。研究团队Wenyuan Pang等强调，这项技术特别适合在缺乏专业设备的偏远地区推广应用，为CSBV的早期防控提供了有力工具，对保护我国中华蜜蜂种质资源具有重要意义。未来研究可进一步扩大样本量和病毒株来源，优化核酸提取步骤，以提升现场检测效率。