克氏锥虫TcFLA-1BP与TcGP72蛋白缺失对细胞感染性及生存力的影响机制研究

这篇研究通过CRISPR/Cas9技术构建克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的TcFLA-1BP?/?和TcGP72?/?双敲除株，揭示二者在鞭毛附着区（FAZ）中的差异化功能：TcFLA-1BP缺失显著降低宿主细胞黏附与感染效率，而TcGP72缺失主要导致细胞骨架重构异常。研究为靶向FAZ蛋白的恰加斯病（Chagas disease）治疗策略提供新见解。

　　

1 引言

克氏锥虫引起的恰加斯病是拉丁美洲主要公共卫生威胁，其生命周期涉及鞭毛附着区（FAZ）介导的形态转换。FAZ作为类桥粒结构，包含TcFLA-1BP（细胞体域）和TcGP72（鞭毛域）等关键蛋白，但二者在哺乳动物感染阶段的功能尚未明确。

2 结果

2.1 基因敲除验证

通过PCR确认敲除株在培养衍生锥鞭毛体（TCT）中持续缺失目标基因，耐药基因标记正确整合。

2.2 鞭毛完整性破坏

免疫荧光显示TcGP72^?/?株100%出现鞭毛完全脱离，而TcFLA-1BP^?/?株64%完全脱离、19%部分脱离。抗FAZ-1抗体（L3B2）检测发现TcGP72缺失导致FAZ蛋白仅聚集于鞭毛袋基部，而TcFLA-1BP缺失后FAZ仍分布于细胞体。

2.3 超微结构异常

扫描电镜（SEM）显示突变体呈现"前鞭毛体样"形态。透射电镜（TEM）揭示TcGP72^?/?株线粒体动质体（kDNA）网络解聚、高尔基体异位等显著细胞器紊乱，而TcFLA-1BP^?/?株仅见核膜-线粒体接触异常。

2.4 表面蛋白分布紊乱

转唾液酸酶（TS）在突变体鞭毛异常富集，提示FAZ结构破坏影响膜蛋白运输。

2.5 感染动力学差异

TcFLA-1BP^?/?株黏附率降低50%，感染指数仅0.4（对照3.2），细胞内增殖周期延长至20小时；而TcGP72^?/?株感染参数与野生型无差异。

2.6 释放延迟

TcFLA-1BP^?/?株在第9天才达释放峰值（5×10⁶/mL），较对照组延迟3天。

3 讨论

研究首次阐明FAZ不同亚域蛋白在克氏锥虫哺乳动物感染阶段的差异化作用：TcFLA-1BP通过维持细胞体域完整性直接影响宿主细胞侵袭，而TcGP72主要调控细胞骨架空间组织。该发现为针对FAZ组件的差异化药物设计提供理论依据。

4 方法

采用LLC-MK2细胞感染模型，结合CRISPR/Cas9基因编辑、多时相感染动力学分析及高分辨率电子显微技术，系统评估表型变化。