小鼠精子形成过程中阶段特异性磷酸化蛋白质组图谱揭示精子形态发生的关键激酶信号调控

这篇研究通过高分辨率磷酸化蛋白质组学技术，首次系统描绘了小鼠精子形成（spermiogenesis）四个发育阶段的动态磷酸化景观，鉴定出3681个差异表达蛋白和5119个差异磷酸化位点。研究发现CSNK1G1激酶调控顶体（acrosome）生物发生，TTBK2激酶通过磷酸化稳定IFT88蛋白从而保障鞭毛（flagella）组装和精子头部塑形。该研究为男性不育（oligo-/astheno-/teratozoospermia）的分子机制提供了新见解，并建立了精子发生过程中激酶信号网络的系统性研究框架。

　　

1 引言

精子形成是精子发生的终末阶段，涉及从圆形精细胞向成熟精子的形态重塑和转录沉默。尽管已知蛋白质翻译后修饰（PTM）尤其是磷酸化在此过程中起关键作用，但阶段特异性的磷酸化动态调控机制尚不明确。研究团队通过同步化小鼠睾丸生精过程，分离1-2、3-4、5-6和13-14期精细胞，结合TMT标记和高灵敏度磷酸化蛋白质组学技术，首次构建了精子形成的四阶段磷酸化图谱。

2 结果

2.1 四阶段精细胞的蛋白质组与磷酸化组特征

通过STA-PUT梯度沉降分离获得纯度>85%的各阶段精细胞（图S1）。定量蛋白质组鉴定到10,292个蛋白，其中35.8%呈现阶段特异性差异表达，主要富集在染色质凝缩、顶体组装、微管组织等通路（图1C-E）。磷酸化组分析发现13,054个磷酸化位点（89.7% pSer，9.9% pThr），包含2,059个新位点（图1F-H）。序列分析显示脯氨酸导向的磷酸化motif占主导（图1I），与已知RIMBP3蛋白的磷酸化动态变化模式一致（图1J）。

2.2 磷酸化动态调控的关键生物学事件

差异磷酸化蛋白主要参与顶体生物发生和鞭毛组装（图2B-C）。顶体相关蛋白GBA2/SMAP2的磷酸化水平随发育下降，而DPY19L2在13-14期显著升高（图2E-F）。鞭毛轴丝组分CEP70等中心体蛋白在早期高磷酸化（图2I），纤维鞘（FS）蛋白AKAP3/4的磷酸化则随发育递减（图2K-L）。值得注意的是，鞭毛运输复合物IFT-B成员（如IFT74-pS300）和驱动蛋白KIF9/KIF17呈现阶段特异性磷酸化波动（图2M-N），暗示其在微管运输中的动态调控。

2.3 激酶-底物网络揭示核心调控模块

通过Mfuzz聚类将磷酸化位点划分为4个时序模块（图3A-B）。激酶富集分析发现27个显著调控激酶，其中CSNK1G1（模块4）和TTBK2（模块2）在精细胞中特异性高表达（图3C）。已有报道显示LATS1和PRKCD与男性生育相关，而PRKG1敲除不影响生育力，因此研究聚焦于CSNK1G1和TTBK2的功能验证。

2.4 CSNK1G1调控顶体发育

免疫荧光显示CSNK1G1从7-8期开始定位于顶体（图4A）。体内siRNA敲降导致顶体空泡化和结构离散（图4I-K），但鞭毛结构正常（图4L）。虽然精子总数和运动力部分下降（图4D-F），提示CSNK1G1主要通过调控顶体成熟影响生育功能。

2.5 TTBK2缺失导致鞭毛缺陷和头部畸形

生精细胞特异性敲除Ttbk2（Stra8-Cre系统）引发完全不育（图5E-F）。睾丸组织学显示鞭毛完全缺失（图5I-J），同时精子头部呈棒状畸形（图6A-B）。超微结构观察发现顶体鞘（ES）滞留和微管manchette结构异常延伸（图6D），伴随γ-tubulin标记的中心体数量异常增加（图7K）。

2.6 TTBK2-IFT88调控轴的作用机制

磷酸化组比较发现Ttbk2敲除后558个位点下调，主要富集于鞭毛组装和manchette形成相关蛋白（图6E-G）。Y2H和Co-IP证实TTBK2与鞭毛运输蛋白IFT88直接互作（图7A-B）。Phos-tag电泳显示IFT88的磷酸化形式在敲除组消失（图7C-D），且蛋白总量下降50%。在Ttbk2^-/-细胞中，过表达野生型TTBK2可恢复IFT88水平和纤毛发生，而激酶死亡突变体（D163A）无此功能（图7E-P），证实TTBK2通过激酶活性依赖的磷酸化维持IFT88稳定性。

3 讨论

该研究首次揭示精子形成过程中磷酸化修饰的时空特异性：早期阶段（1-6期）主要调控鞭毛组装和微管重组，晚期（13-14期）主导染色质重塑。TTBK2-IFT88轴的发现拓展了该激酶在非经典纤毛结构（如manchette）中的功能认知，为解释男性不育患者中常见的畸形精子症（teratozoospermia）提供了新机制。研究局限性在于部分磷酸化位点的功能验证尚未完成，未来可通过基因编辑技术进行定点突变研究。

5 实验方法

关键技术包括：WIN18,446/视黄酸（RA）同步化生精周期、STA-PUT精细胞分选、TMT16-plex标记、Ti-IMAC磷酸肽富集、Orbitrap Fusion Lumos质谱分析。生信流程采用MaxQuant定量、Mfuzz时序聚类、GPS 5.0激酶预测。表型分析结合计算机辅助精液分析（CASA）、透射电镜（TEM）和Phos-tag蛋白质印迹等技术。