CRISPR介导的植物基因组靶向T-DNA整合技术CRISTTIN的多功能应用研究

这篇综述创新性地提出CRISPR-aided targeted T-DNA integration（CRISTTIN）技术，通过CRISPR诱导双链断裂（DSB）实现T-DNA在拟南芥和水稻中的精准整合。研究发现传统Cas9系统优于设计的Cas9-适配体融合核酸酶，并系统验证了该技术在基因敲除与原位互补（如FERONIA和AGAMOUS）、转录增强（35S enhancers）及启动子活性监测（RUBY报告系统）等场景的应用价值，为植物功能基因组学和合成生物学研究提供了高效工具。

　　

ABSTRACT

研究团队开发了基于CRISPR的靶向T-DNA整合技术CRISTTIN，通过CRISPR-Cas9诱导双链断裂（DSB）促进农杆菌介导的T-DNA在植物基因组中的精准插入。与传统随机整合相比，该技术显著降低了插入突变风险并提高了转基因表达稳定性。值得注意的是，常规Cas9的表现优于设计的Cas9-适配体融合蛋白，后者通过拟南芥importin α-3的53个氨基酸片段（IMPα^1–53）与VirD2相互作用试图增强T-DNA靶向性，但实际效率反而降低。

1 Introduction

农杆菌介导的T-DNA转移是植物遗传转化的核心技术，但其随机整合特性可能导致内源基因破坏或转基因表达不稳定。研究团队发现T-DNA优先整合于DSB位点，这为CRISPR介导的靶向整合提供了理论基础。尽管已有研究尝试通过锌指核酸酶（ZFNs）或TALENs实现靶向整合，但CRISPR/Cas系统因其设计简便性更具优势。特别的是，Cas9在切割后能长时间滞留于DSB位点，这为VirD2/T-DNA复合物的锚定创造了条件。

2 Results

2.1 53-aa VirD2相互作用肽段的鉴定

通过双分子荧光互补（BiFC）实验，团队在拟南芥importin α-3的N端鉴定出最小53个氨基酸的VirD2结合域（IMPα^1–53）。该片段与Cas9的C端融合后仍保持核酸酶活性，并能通过免疫共沉淀验证其与VirD2的相互作用。

2.2 常规Cas9在靶向整合中的优势

在拟南芥ABI3和ETC2位点的比较实验中，使用SaCas9（含NNGRRT PAM）的非锚定策略靶向整合效率达10.53%，而Cas9-IMPα^1–53融合蛋白仅4.47%。测序显示T-DNA存在双向（LB-RB/RB-LB）和非典型（LB-LB/RB-RB）整合模式，且连接处常伴随indel突变。

2.3 基因敲除效果验证

在ETC2位点获得纯合T-DNA插入株系后，qPCR检测显示其mRNA水平较野生型显著降低，证实了外显子插入的有效敲除效果。

2.4 基因功能研究的并行策略

以FERONIA（FER）为例，团队通过单次转化同时获得激酶失活突变体（FER^K565R）和野生型互补株系。表型分析显示FER^K565R在营养生长期呈现小莲座状，但生殖发育正常，精准复现了该激酶功能的时空特异性。

2.5 合成生物学应用实例

在AGAMOUS（AG）位点整合AP1启动子驱动的RUBY报告基因（编码甜菜红素合成酶），成功获得粉红色重瓣花水稻，其花期延长至7-10天，展示了代谢工程与形态改造的协同效应。

2.6 精准转录激活

将四拷贝35S增强子定点插入TOR、PAP1/AFP2基因簇等位点，使靶基因表达提升3倍以上。值得注意的是，在双向启动子控制的PAP1/AFP2基因对中，单个位点插入即可实现共激活。

2.7 启动子捕获新技术

通过在内含核糖体进入位点（IRES）的LUC-T2A-GFP报告系统，在CCA1基因5'端实现11.01%的靶向整合。全基因组测序验证的单拷贝株系#13-42表现出与内源基因同步的昼夜节律振荡，证实了该策略在时空表达分析中的精确性。

2.8 单子叶植物验证

在水稻CERK1位点实现3.7%的靶向整合，通过导入拟南芥源JM结构域（AtJM）创制抗真菌种质，展示了跨物种应用的潜力。

3 Discussion

与HDR介导的基因靶向相比，CRISTTIN更适合大片段（>10kb）整合，但在插入方向控制方面存在局限。研究揭示了Cas9-适配体策略效率降低的三种可能机制：VirD2的宿主因子竞争、T-DNA核内解离以及空间位阻效应。该技术与同期报道的sequential transformation方法形成互补，共同推动了植物精准遗传操作体系的建立。

4 Materials and Methods

实验采用拟南芥Col-0和水稻ZH11为材料，使用EC1启动子驱动SaCas9表达。通过四引物PCR策略（两基因组引物+两T-DNA边界引物）鉴定整合事件，Hi-TOM平台分析编辑效率。qPCR以ACT1/TOR为单拷贝参照，昼夜节律实验采用12h光/暗循环，生物发光成像使用3mM荧光素底物。