光诱导发色团解离引发聚集诱导红色荧光：PhoCl1蛋白C端肽片段的光物理行为解析

本研究揭示了光解荧光蛋白PhoCl1在405 nm光照下释放的C端肽片段(CTPF)通过分子聚集产生红色荧光的机制。研究人员通过动态光散射、荧光光谱和分子动力学模拟证实，含有IE-p-HBI发色团的9氨基酸肽链(NRVFTKYPR)在水相中形成聚集体，产生570 nm特征发射（量子产率0.23%）。该发现突破了光解蛋白片段无荧光的传统认知，为开发光激活荧光系统、聚集诱导发光(AIE)生物传感器及响应性生物材料提供了新思路。

　　

在生命科学研究中，荧光蛋白犹如分子世界的"荧光笔"，帮助科学家在活细胞中描绘生命活动的精细图谱。绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物通过独特的β-桶状(β-barrel)结构保护内部发色团p-HBI（4-(对羟基亚苄基)-5-咪唑啉酮），成为生物成像的基石工具。然而，光转换蛋白家族中一个特殊成员——光解荧光蛋白PhoCl1，却展现出令人费解的行为：当接受405 nm光照时，它不像其他光转换蛋白那样在β-桶内完成绿色到红色荧光的转换，而是通过光解离释放出携带发色团的C端肽片段(CTPF)，导致母体蛋白荧光淬灭。传统观点认为这种解离会使发色团在水环境中失去荧光能力，但Yashwant Kumar团队的最新发现颠覆了这一认知。

发表在《Communications Biology》的这项研究，首次揭示了CTPF片段通过分子聚集产生红色荧光的现象。研究人员采用多学科交叉方法，通过Ni-NTA色谱分离光解产物，结合MALDI-TOF质谱验证CTPF纯度；运用动态光散射(DLS)检测聚集体尺寸分布；利用稳态/瞬态荧光光谱测定光物理参数；并借助分子动力学(MD)模拟和量子力学/分子力学(QM/MM)计算阐释分子机制。实验样本为重组表达的6xHis-PhoCl1蛋白，经体外光解获得CTPF片段。

光解离产物显现意外红光

研究发现，PhoCl1在405 nm LED照射6小时后，溶液颜色从绿色转变为橙红色，光谱检测显示570 nm处出现新发射峰。通过Ni-NTA色谱分离获得纯化CTPF，MALDI-TOF确认其分子量为1503.042 Da（理论值1498.73 Da），SDS-PAGE显示无母体蛋白污染。

聚集行为的光物理证据

DLS分析显示，光解混合物中出现1224±275 nm的聚集体，而纯化CTPF粒径达477±79 nm。荧光表征显示CTPF具有470 nm激发/570 nm发射特性，但量子产率仅0.23%，荧光寿命0.34±0.04 ns，显著低于完整PhoCl1（2.2±0.04 ns）。各向异性测试显示旋转相关时间0.1 ns，暗示聚集体中发色团运动受限。

计算模拟揭示分子机制

600 ns的MD模拟显示，15个CTPF分子在400 ns内通过疏水作用完成聚集，色团溶剂可及表面积(SASA)减少。QM/MM计算证实，含水8分子时色团的540-590 nm发射与实验数据吻合，说明水分子屏蔽是荧光产生的关键。

环境响应特性

CTPF荧光强度随温度升高(25→65°C)而降低，但在高盐(2 M NaCl)条件下增强。pH实验显示酸性环境(pH5.0)导致发射峰蓝移，归因于色团质子化。

这项研究不仅阐明了PhoCl1光解产物的反常荧光行为，更开辟了多个研究方向：首先，聚集诱导的红色荧光现象为开发新型光激活标记系统提供了思路；其次，CTPF的环境响应特性可用于设计刺激响应型生物材料；最后，该发现提示在光遗传学工具开发中需重新评估蛋白片段的行为。尽管CTPF的低亮度限制其直接成像应用，但其独特的聚集依赖发光机制为AIE生物传感器设计提供了天然模板。未来研究可聚焦于工程化改造CTPF序列以调控聚集程度，或将其整合至智能材料体系实现可控组装。这项由Karthik Pushpavanam团队完成的工作，完美展示了基础发现如何转化为应用创新，为蛋白质光工具开发提供了新范式。