米曲霉中G蛋白偶联受体与G蛋白α亚基互作网络的系统性解析及其功能意义

本研究针对丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)中G蛋白偶联受体(GPCRs)与G蛋白α亚基(Gαs)互作特异性不明的科学问题，通过双分子荧光互补(BiFC)技术系统鉴定了12对GPCR-Gα互作组合，并利用基因敲除实验验证了GprM/GprO-GpaA信号通路在菌丝生长和孢子形成中的调控作用，为阐明真菌环境感知的分子机制提供了重要依据。

　　

在真菌王国中，G蛋白偶联受体(GPCRs)犹如精密的"分子天线"，负责感知外界环境变化并启动相应的细胞应答。作为真核生物中最大的膜受体家族，GPCRs通过与其配对的G蛋白α亚基(Gαs)相互作用，调控着从人类疾病到工业发酵等众多生命过程。然而在丝状真菌这一重要微生物类群中，GPCR-Gα互作的特异性规律仍如"黑箱"般未被揭示。米曲霉(Aspergillus oryzae)作为传统酿造工业的"明星菌种"和现代生物技术的模式菌株，其环境适应性的分子基础研究具有重要理论和应用价值。

针对这一科学盲区，Itsuki Sakamoto、Dong Min Kim和Manabu Arioka研究团队在《Mycological Progress》发表了创新性研究成果。研究采用双分子荧光互补(BiFC)这一可视化技术，系统扫描了米曲霉中9个GPCRs与3个Gαs的所有可能组合；通过构建GPCR-cEGFP和nEGFP-Gα融合表达体系，结合野生型Gα过表达竞争实验，严格验证了12对特异性互作组合的真实性。特别聚焦GpaA互作伙伴GprM和GprO，研究团队进一步利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建缺失突变株，通过表型分析揭示了这些受体-效应器组合在白色菌核形成、孢子产生及菌落扩展等发育过程中的调控作用。

【关键技术方法】

研究以米曲霉ku70缺陷株NSRku70-1-1A为遗传操作背景，主要采用：1) 双分子荧光互补技术，构建27种GPCR-cEGFP/nEGFP-Gα组合菌株；2) 野生型Gα过表达竞争实验作为阴性对照；3) CRISPR-Cas9系统构建gprM、gprO和gpaA基因缺失突变体；4) 显微观察与表型分析平台，定量测定菌核数量、孢子产量等参数。

【研究结果】

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   GPCR-Gα互作网络的构建

   通过BiFC筛选发现12对阳性互作组合，包括GprA/B-H与GpaB的特异性结合，以及GprC/D与多个Gα的交叉互作。荧光定位显示GprA-GpaB等组合定位于质膜，而GprM-GpaA等则形成胞质荧光斑点。

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   互作特异性的验证

   野生型Gα过表达显著抑制了对应BiFC菌株的荧光信号，证实观察到的重组荧光源自特异性互作而非随机碰撞。仅GprO-GpaB组合显示部分抗干扰能力，提示可能存在特殊结合模式。

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   生理功能的关联分析

   ΔgprM突变体再现了ΔgpaA的白色菌核减少和孢子增多的表型，而ΔgprO则与ΔgpaA在黑色菌核成熟和菌落扩展缺陷方面表现相似。这种表型"部分重现"现象证实BiFC检测的物理互作具有生理相关性。

【结论与意义】

该研究首次在米曲霉中绘制了GPCR-Gα互作网络图谱，揭示了GprM/GprO-GpaA信号轴在真菌发育调控中的核心地位。创新性地将BiFC技术应用于丝状真菌信号转导研究，为解析GPCR-Gα选择规律建立了方法学范式。发现的多对跨界保守互作组合（如GprC/D-GpaB与酵母Gpr1-Gpa2同源）为理解G蛋白信号通路的进化提供了新视角。研究成果不仅深化了对真菌环境感知机制的认识，也为通过理性改造GPCR-Gα信号系统优化工业菌株性能奠定了理论基础。特别值得注意的是，研究中发现的胞质区室化信号现象（如内体/高尔基体定位的BiFC信号）为探索非经典GPCR信号转导途径开辟了新思路。