多功能细胞穿透肽RALA实现原代干细胞多模式CRISPR基因编辑的突破性进展

这篇研究首次报道了RALA细胞穿透肽(CPP)作为多功能非病毒载体，可高效递送CRISPR系统(pDNA/mRNA/RNP)至原代间充质干细胞(MSCs)，在基因敲除(KO)、敲入(KI)和转录激活(CRISPRa)等编辑模式中均展现卓越性能。其纳米颗粒(<150nm)通过静电自组装形成，转染效率优于商业试剂(Lipofectamine/PEI)，且能保持细胞活力和增殖能力，在体内外实验中成功实现荧光报告基因编辑，为干细胞治疗提供了安全高效的新型递送工具。

　　

多功能细胞穿透肽RALA的CRISPR递送突破

摘要

CRISPR基因编辑技术为精准调控细胞功能提供了前所未有的基因组和转录组控制能力。然而，如何安全高效地将CRISPR组件递送至治疗相关细胞类型仍是重大挑战。本研究首次证实两亲性肽RALA能通过静电相互作用自组装形成纳米颗粒，有效包封和递送多种形式的CRISPR组件至原代间充质干细胞(MSCs)，在基因敲入、敲除和转录激活等不同编辑模式中均展现出卓越性能。

引言

CRISPR技术通过Cas核酸酶和引导RNA(gRNA)的协同作用，实现了基因敲除、敲入、激活或抑制等精准编辑。相比锌指核酸酶等传统工具，CRISPR具有设计简便、特异性高和可多重靶向等优势。然而，原代干细胞(如MSCs)的编辑仍面临递送效率低、细胞毒性大等问题。病毒载体易引发免疫反应和随机整合，而物理方法(如电转染)则导致高细胞死亡率。脂质纳米颗粒虽在mRNA疫苗中表现优异，但存在转录组干扰风险。

RALA肽的独特优势

RALA是一种由精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸重复序列组成的螺旋型两亲性肽，能通过静电作用与带负电分子自组装形成纳米颗粒。其通过网格蛋白介导的内吞等多途径穿透细胞膜，对MSCs、树突状细胞等难转染细胞类型特别有效。关键的是，RALA转染后MSCs仍保持多向分化能力，且重复给药不会诱发抗体产生。

结果与讨论

RALA纳米颗粒的特性表征

研究系统评估了RALA与不同CRISPR组件(pDNA/mRNA/RNP)的复合比例。结果显示：

• •

  pDNA在N/P=5时形成稳定纳米颗粒(粒径<150nm，zeta电位+16.6mV)，转染率达22.5%

• •

  RNP在100×摩尔比时最优，Cas9-GFP核定位明确

• •

  mRNA在N/P=7时转染率53.1%，包封效率均>80%

与商业试剂对比

RALA在pDNA递送中虽转染率(22.5%)低于Lipofectamine(42.3%)，但细胞存活率(57.7% vs 4.1%)和总编辑细胞数显著占优。mRNA递送同样展现类似优势，证实RALA能产生更多健康编辑细胞。

基因编辑应用

1. 1.

   基因敲入：通过共递送Cas9 RNP/pDNA和RFP-LUC供体模板，在ROSA26安全港位点实现0.84%敲入效率，经测序验证正确整合

2. 2.

   基因敲除：靶向RFP的RNP递送获得63.9%敲除效率，显著高于Lipofectamine CRISPRMAX(8.8%)

3. 3.

   转录激活：dCas9-VPR mRNA递送成功上调TGFB3(1.44倍)、BMP2(23.6倍)和TNMD(97.1倍)等治疗相关基因

体内验证

在FVB-Tg(CAG-luc,-GFP)报告小鼠中，肌肉注射RALA-RNP使荧光素酶信号降低27.5%，GFP表达减少37%，首次证明肽介导的CRISPR体内编辑可行性。

创新意义

该研究突破性地证明：

1. 1.

   RALA是首个能递送所有CRISPR分子形式的非病毒载体

2. 2.

   在保持细胞活力方面显著优于商业试剂

3. 3.

   支持从基因敲除到表观调控的全谱编辑

4. 4.

   为干细胞治疗和遗传病提供了安全高效的递送方案

未来展望

研究团队计划进一步优化纳米颗粒配方以增强细胞特异性，开发缓释系统延长CRISPRa作用时间，并探索在杜氏肌营养不良等疾病模型中的应用。RALA平台的出现为基因编辑的临床转化提供了重要工具。