超级增强子介导的DLX5激活揭示人胚胎干细胞来源成骨细胞的调控机制

这篇研究通过ATAC-seq和RNA-seq技术，揭示了人胚胎干细胞（hESC）来源成骨细胞在骨骼发育中的独特染色质可及性和转录调控特征。研究发现，与骨髓间充质干细胞（BM-MSC）分化的成骨细胞相比，hESC来源成骨细胞富集了与骨化相关的调控基因集，并鉴定出DLX5基因关联的超级增强子（super-enhancer），其通过多组分协同增强子驱动转录。该研究为人类骨骼发育的顺式-反式（cis-trans）调控机制提供了重要资源，突出了DLX5作为成骨细胞分化的关键转录调控因子。

　　

摘要

骨骼发育和稳态依赖于成骨细胞的分化。尽管骨髓间充质干细胞（BM-MSC）常用于骨稳态研究，但其与人类骨骼发育中成骨细胞分化的关联尚不明确。本研究利用Col2.3-GFP报告基因标记的人胚胎干细胞（hESC）来源的诱导生骨节，通过体内植入系统分离成骨细胞，结合转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）和RNA-seq分析，揭示了与骨骼发育相关的染色质开放性和转录特征。与BM-MSC来源成骨细胞的比较分析显示，hESC来源成骨细胞显著富集骨化相关调控基因集，并发现DLX5基因的超级增强子（super-enhancer）通过多组分增强子协同驱动转录。

1 引言

骨骼系统支撑机体并调控矿物质稳态。小鼠研究表明，成骨细胞在软骨内骨化中起源于软骨膜细胞或肥大软骨细胞转分化，而成年后主要来源于骨髓中的瘦素受体（LepR）阳性间充质干细胞（BM-MSC）。这种起源差异可能导致成骨细胞的生物学特性不同，但其转录组和染色质可及性差异仍需阐明。

基因调控机制涉及转录因子及其顺式调控元件（CREs）。RUNX2和SP7等转录因子是骨骼发育和稳态的关键调控因子。超级增强子（SE）是增强子簇，通过高密度转录因子和组蛋白修饰激活细胞特异性基因表达程序。与BM-MSC来源成骨细胞相比，人类发育阶段成骨细胞的组学数据较少。

本研究利用hPSC来源的生骨节植入免疫缺陷小鼠，模拟胎儿期软骨内骨化过程，结合Col2.3-GFP报告基因标记的hESC分离成骨细胞，分析其转录组和染色质可及性特征，重点关注顺式-反式调控机制和超级增强子的作用。

2 方法

2.1 hESC向生骨节的分化

使用H9Zn2.3GFP hESC细胞系，通过化学小分子诱导分化为生骨节：

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  第0天：用CHIR99021诱导原始条纹（PS）；

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  第1天：用CHIR99021、A 83–01和LDN193189诱导轴旁中胚层（PM）；

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  第2天：用C59、A 83–01和LDN193189诱导体节中胚层（SM）；

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  第3天：用SAG、C59和LDN193189诱导生骨节（SCL）。

2.2 体内植入

将诱导的生骨节细胞与Matrigel混合，植入NOD SCID小鼠的肾包膜下或皮下，12–28周后收集组织。

2.3 组织学分析

通过免疫组化（IHC）检测GFP阳性细胞，石蜡切片进行HE和DAB染色。

2.4 测序分析

通过荧光激活细胞分选（FACS）分离GFP+细胞，进行ATAC-seq和RNA-seq。数据分析包括：

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  ATAC-seq：比对到GRCh38基因组，用MACS2调用峰值；

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  RNA-seq：比对到人类和小鼠基因组，用RSEM定量基因表达；

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  超级增强子分析：使用ROSE算法鉴定SE，并与保守性（PhastCons评分）和基因表达关联。

2.5 荧光素酶报告实验

构建包含DLX5远端增强子（DE）和CTCF簇的荧光素酶载体，转染NIH3T3（成纤维细胞）、ATDC5（软骨细胞）和MC3T3-E1（成骨细胞），检测细胞特异性增强子活性。

3 结果

3.1 Col2.3-GFP+细胞具有成骨细胞特性

GFP+细胞高表达COL1A1和IBSP等成骨标志物，低表达SOX5/SOX6/SOX9等软骨相关基因。GO分析显示其富集骨骼发育相关通路。ATAC-seq揭示成骨细胞特异性远端CREs， motif分析发现RUNX、DLX和bZIP等转录因子结合位点富集。

3.2 与BM-MSC来源成骨细胞的差异

PCA显示hESC来源成骨细胞与BM-MSC来源细胞显著分离。hESC来源细胞高表达BGLAP、SP7和DLX5，而BM-MSC来源细胞高表达LEPR和TERT。GO分析表明hESC来源细胞更富集骨骼发育相关基因。

3.3 DLX5超级增强子的功能

鉴定出402个SE，其中DLX5关联的SE排名第4。该SE包含高度保守的DE和CTCF簇。荧光素酶实验显示：

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  DLX5 DE在成骨细胞中活性最强；

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  CTCF簇单独无活性，但与DE协同显著增强转录。

4 讨论

本研究首次揭示了hESC来源成骨细胞的染色质开放性和转录特征，其与BM-MSC来源细胞的差异可能反映发育阶段或微环境的影响。DLX5 SE通过多组分增强子协同驱动成骨细胞特异性表达，为骨骼发育的调控机制提供了新见解。未来需验证DE在其他组织（如颅面或神经）中的活性，并探索非编码变异在骨骼疾病中的作用。

作者贡献与致谢

S.T.和S.F.完成实验与数据分析，H.H.设计课题。感谢David W. Rowe提供细胞系及JSPS、AMED等基金支持。