基于多重CRISPR/Cas9策略的转基因植物选择标记基因高效剔除技术研究

本文创新性开发了一种基于多重CRISPR/Cas9系统的选择标记基因（SMG）剔除策略，通过设计靶向DsRED标记基因两侧的4个gRNA，在转基因烟草中实现10%的SMG精准删除效率。该技术成功获得表型正常、可育的T1代无标记转基因植株，为转基因作物商业化面临的生物安全与监管难题提供解决方案。

　　

引言

遗传转化技术依赖选择标记基因（SMG）筛选转基因材料，但SMG持续存在引发生物安全担忧。传统方法如共转化、Cre/lox重组等存在效率低或残留外源序列等问题。CRISPR/Cas9系统通过gRNA引导Cas9核酸酶靶向切割DNA，利用NHEJ或HDR修复机制实现基因编辑，为SMG剔除提供新思路。

材料与方法

以携带DsRED（SMG）和NPT II（目的基因，GOI）的烟草为材料，设计靶向SMG侧翼区域的4个gRNA，构建含tRNA-gRNA多顺反子（PTG）的pHSE401-SMGDEL载体。通过农杆菌介导转化，在含25 mg/L潮霉素培养基中筛选再生苗，荧光显微镜初筛无红色荧光植株，PCR和测序验证SMG删除。

结果

1. 1.

   SMG删除效率分析

   20%再生苗丧失红色荧光，其中10%经PCR确认产生250 bp小片段，测序显示1841-1881 bp大片段删除。突变分析发现5'gRNA2靶区100%突变率，部分株系出现序列倒位。

2. 2.

   基因表达特征

   qPCR显示SMG删除株系中DsRED表达消失，Cas9和NPT II持续表达。T₁代通过分离获得无Cas9的无标记转基因植株。

3. 3.

   表型观察

   所有编辑植株生长周期、育性与野生型无差异，种子发芽率达100%。

讨论

多重gRNA设计显著提升大片段删除效率（达10%），优于单gRNA策略。PTG系统实现4个gRNA协同作用，且位置不影响编辑效率。相比同类研究，本方案在已转化株系中操作，避免共转化带来的连锁风险。

结论

该研究建立的高效SMG剔除体系具有普适性，可应用于多种转基因作物，为解决转基因产品商业化面临的监管障碍提供关键技术支撑。