猕猴桃脯氨酸代谢基因组的全基因组鉴定与表达分析：AcP5CS1在盐胁迫耐受中的关键作用

本研究通过全基因组分析在猕猴桃中鉴定出8个脯氨酸代谢关键基因（AcP5CS1/2、AcP5CR、AcOAT、AcPDH1/2/3和AcP5CDH），系统揭示了其系统进化、表达模式及调控机制。研究发现盐胁迫显著上调AcP5CS1/AcP5CR/AcOAT表达并抑制AcP5CDH，通过转基因实验证实AcP5CS1过表达能增强拟南芥耐盐性，并首次揭示AcNAC30转录因子通过直接结合AcP5CS1启动子（CATGT motif）调控脯氨酸积累的分子机制，为猕猴桃抗逆育种提供新靶点。

　　

1 引言

作为新兴的经济作物，猕猴桃（Actinidia chinensis）因其高维生素C含量广受欢迎，但其生长易受盐害等非生物胁迫影响。脯氨酸作为多功能相容性溶质，在维持细胞渗透平衡、清除活性氧（ROS）和稳定膜结构方面具有重要作用。植物通过谷氨酸和鸟氨酸两条途径合成脯氨酸，其中Δ¹-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是限速酶，而脯氨酸脱氢酶（PDH）和吡咯啉-5-羧酸脱氢酶（P5CDH）负责其降解。尽管在拟南芥、水稻等模式植物中已有研究，但猕猴桃脯氨酸代谢基因家族的系统鉴定及其调控网络仍属空白。

2 结果

2.1 脯氨酸代谢基因家族的鉴定与特征

从猕猴桃基因组中鉴定出8个关键基因，包括2个AcP5CSs（AcP5CS1:716 aa、AcP5CS2:77.33 kDa）、1个AcP5CR（pI=10.07）、1个AcOAT、3个AcPDHs和1个AcP5CDH（pI=5.72）。系统发育分析显示，AcP5CS1/2与葡萄（Vitis vinifera）同源基因亲缘关系最近，暗示其在进化过程中的保守性。

2.2 基因结构与调控元件

基因结构分析揭示AcP5CS1/2含有20个外显子的复杂结构，而AcPDH1-3仅含3-4个外显子。启动子分析发现所有基因均含有茉莉酸甲酯（Me-JA）响应元件CGTCA/TGACG，其中AcP5CS1/2和AcOAT还含有乙烯响应元件ERE，暗示激素调控的多样性。

2.3 表达模式分析

组织特异性表达显示AcP5CS1在果实中高表达，AcOAT在花中优势表达。盐胁迫下，AcP5CS1/AcP5CR/AcOAT表达量分别激增6.8倍、5.2倍和4.5倍，而AcP5CDH被显著抑制。激素处理实验表明，茉莉酸（JA）可强烈诱导AcP5CS1/2表达，赤霉素（GA）则特异性激活AcPDH1/2。

2.4 AcNAC30的调控机制

通过RNA-seq关联分析发现AcNAC30（Actinidia09980）与AcP5CS1表达高度正相关（R≈0.99）。双荧光素酶报告系统证实AcNAC30可使AcP5CS1启动子活性提升3.2倍，电泳迁移率变动实验（EMSA）进一步验证其直接结合启动子的CATGT motif。

2.5 转基因功能验证

过表达AcP5CS1的拟南芥株系（OE3/OE8/OE11）在150 mM NaCl处理下，根系长度比野生型增加58%，脯氨酸含量提高2.3倍。DAB/NBT染色显示转基因植株H₂O₂和O₂^-积累量显著降低，证实其通过增强抗氧化能力缓解盐害。

3 讨论

本研究首次揭示猕猴桃通过协调AcP5CS1介导的谷氨酸途径和AcOAT参与的鸟氨酸途径共同促进脯氨酸积累。AcNAC30转录因子的发现为解析脯氨酸代谢的转录调控网络提供了新视角，其与AcP5CS1的调控关系在蔷薇科植物中具有保守性。与棉花GhP5CS1基因沉默导致盐敏感表型相比，本研究的转基因结果进一步验证了P5CS基因在抗逆中的普适性功能。

4 材料与方法

实验采用'红阳'猕猴桃组培苗，通过qRT-PCR（引物见附表）、双荧光素酶报告系统、EMSA和转基因等技术，结合生物信息学分析（MEME、PLACE数据库等）完成基因鉴定与功能验证。

5 结论

该研究不仅阐明了猕猴桃脯氨酸代谢基因家族的进化特征，还建立了AcNAC30-AcP5CS1分子模块调控盐胁迫响应的理论框架，为分子设计育种提供了重要靶标基因。未来可通过CRISPR/Cas9等技术创制AcP5CS1编辑株系，进一步优化猕猴桃抗逆性状。