极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus中保守UPF0235家族蛋白PF1765的晶体结构与核酸结合活性解析

本文首次报道了极端嗜热古菌P. furiosus中UPF0235家族蛋白PF1765（UniProt: Q8U052）的1.3?高分辨率晶体结构，揭示其独特的β(4)-α-β(2)-α拓扑伪β桶状结构。通过生物物理表征（EMSA/FP实验）证实该蛋白虽无典型核酸结合域，却能广谱结合dsDNA/ssDNA/RNA，为DUF167（PF02594）功能未知蛋白家族提供了首个结构-功能范式。

　　

Highlight

PF1765纯化与生物物理表征

从P. furiosus基因组PCR扩增的PF1765编码序列（CDS）被克隆至pST50Tr载体，获得N端Strep-His₆-TEV标签（~3.8kDa）的重组蛋白。Sanger测序验证后，在大肠杆菌（E. coli）中实现可溶性表达，每升培养物可获得40mg纯度>95%的蛋白（图S1A）。有趣的是，TEV蛋白酶未能有效切除标签，推测与PF1765的刚性N端结构有关。动态光散射（DLS）显示其水合半径为2.3nm，与单体状态（13.9kDa）相符。差示扫描量热法（DSC）揭示该蛋白具有惊人的热稳定性，熔解温度（T_m）高达95°C，完美适配其嗜热宿主生存环境。

PF1765晶体结构解析

通过同步辐射光源获得1.3?分辨率晶体结构（PDB提交中），展示出独特的β(4)-α-β(2)-α拓扑：6条反平行β链构成伪β桶，包裹着2个α螺旋。保守的P17/P41-P42转角与N48-K74盐桥形成结构稳定核心。DALI比对显示其与已知功能蛋白均无显著相似性（Z-score<6），但AlphaFold3预测的同源模型跨三界生物均保持高度保守（RMSD<1.63?），暗示该折叠可能执行基础生命功能。

核酸结合功能验证

计算机预测提示PF1765表面存在带正电的核酸结合口袋。电泳迁移率变动实验（EMSA）显示其能剂量依赖性结合线性/超螺旋dsDNA、ssDNA及16S rRNA，解离常数（K_d）在微摩尔级。荧光偏振（FP）实验进一步证实，该蛋白对含AT-rich序列的DNA片段表现出更强亲和力。值得注意的是，虽然缺乏HTH或OB-fold等典型核酸结合域，但其β桶表面的赖氨酸簇（K74/K94/K101）可能通过静电作用实现核酸识别。

Conclusion:

本研究破解了UPF0235蛋白家族首个高分辨率结构，揭示PF1765通过创新性折叠模式实现广谱核酸结合。其极端热稳定性与跨三界保守性暗示该家族可能在高温环境核酸代谢中扮演关键角色，为理解生命早期进化提供了新视角。