芜菁基因组与DNA甲基化调控低温诱导内叶黄化的分子机制研究

本研究针对芜菁(Brassia rapa)在秋冬季节低温诱导内叶黄化的独特表型，通过构建染色体级别参考基因组(480.57 Mb，scaffold N50 46.53 Mb)和全基因组甲基化测序(WGBS)，揭示了CHH型甲基化通过调控叶绿素代谢关键基因(如BrCLH2.1)表达驱动颜色转变的分子机制。研究发现DNA甲基转移酶BrCMT2/BrDRM2的低温响应性表达调控全基因组CHH甲基化水平，而甲基化抑制剂处理证实表观遗传调控对叶绿素降解的关键作用。该研究为十字花科作物抗逆育种提供了重要基因组资源和理论依据。

　　

在长江-淮河流域栽培千年的芜菁(Brassica rapa ssp. chinensis cv. Wucai)以其独特的低温响应表型著称——当秋冬气温下降时，内叶会由绿转黄。这种"温度感应型"变色现象在非结球白菜中独具特色，但长期以来缺乏基因组层面的解析。更令人困惑的是，传统遗传学难以解释这种可逆性表型变化背后的调控机制。随着表观遗传学的发展，DNA甲基化等修饰被证实在植物环境适应中起关键作用，但温度响应性叶片变色的表观调控网络仍是未解之谜。

为破解这一科学问题，安徽农业大学园艺学院王成刚团队在《Horticulture Research》发表了突破性研究成果。研究团队综合运用Nanopore长读长测序、Hi-C染色体构象捕获技术构建了染色体级别的芜菁参考基因组，通过全基因组甲基化测序(WGBS)和转录组分析，结合甲基化抑制剂处理等实验，系统揭示了DNA甲基化调控低温诱导叶片黄化的分子机制。

关键技术方法包括：1) 采用Illumina短读长和Nanopore长读长测序技术对芜菁品种W7-2进行基因组测序，结合Hi-C技术获得染色体级别组装；2) 通过全基因组甲基化测序(WGBS)分析低温处理前后(G/Y/RG三个阶段)的DNA甲基化动态变化；3) 使用5-氮杂胞苷(5-azacytidine)进行甲基化抑制实验验证表观调控功能；4) 通过农杆菌介导的烟草瞬时表达系统验证候选基因BrCLH2.1的功能。

基因组特征与进化分析

研究组装的芜菁W7-2基因组大小为480.57 Mb，scaffold N50达46.53 Mb，包含42,634个蛋白编码基因。比较基因组分析发现，W7-2与已发表的其他芜菁品种(B. rapa Chiifu、NHCC001等)存在显著结构变异，其中转座元件(TEs)占基因组的55.08%，长末端重复序列(LTRs)占比最高(27.97%)。Ks分析表明芜菁经历过一次全基因组三倍化事件(WGT)，而W7-2特有的685个基因家族在油菜素内酯合成、α-亚麻酸代谢等通路富集，可能与其抗寒性相关。

DNA甲基化动态特征

全基因组甲基化分析发现低温诱导的黄化阶段(Y)CHH甲基化水平显著升高，而恢复常温后(RG)CHH甲基化水平下降。DMR分析显示，RG/Y比较中CHH启动子区的hypo-DMRs(低甲基化差异区域)显著增加。DNA甲基转移酶表达分析表明，BrCMT2和BrDRM2在Y阶段显著上调，与CHH甲基化水平变化趋势一致。甲基化抑制剂处理实验证实，DNA甲基化抑制会导致叶片明显白化和叶绿素含量下降，验证了甲基化调控的生物学功能。

叶绿素代谢的甲基化调控

通过整合甲基组和转录组数据，发现叶绿素代谢通路基因(BrHemA、BrCLH2、BrSGR等)的启动子区CHH甲基化水平与表达量呈负相关。其中BrCLH2.1在Y阶段表达上调伴随启动子区CHH低甲基化，而RG阶段则呈现相反趋势。烟草瞬时表达实验证实BrCLH2.1过表达能显著降低叶绿素含量，L和b色度值增加，表明其直接参与叶绿素降解过程。

这项研究首次构建了芜菁染色体级别参考基因组，揭示了温度响应性叶片变色的表观遗传调控机制。研究发现CHH型甲基化通过动态调控叶绿素代谢基因表达驱动颜色转变，其中BrCLH2.1被鉴定为关键效应基因。这不仅丰富了植物环境适应的表观调控理论，也为十字花科作物品质改良提供了新靶点——通过调控DNA甲基转移酶活性或靶基因甲基化状态，可能实现作物外观性状的精准调控。该研究建立的基因组资源将加速芜菁及其他Brassica作物的分子育种进程。