CRISPR-Cas9介导FOXP3基因敲除增强CAR-T细胞功能：突破肿瘤免疫治疗中T细胞耗竭的新策略

本研究针对CAR-T细胞疗法在持续抗原刺激下易发生功能耗竭的关键问题，通过CRISPR-Cas9技术敲除转录因子FOXP3，显著提升了CD19靶向CAR-T细胞的细胞因子分泌能力和持续杀伤功能。研究发现FOXP3在CAR激活后表达上调，其缺失虽不影响耗竭标记物表达，但能增强IFN-γ、TNF-α等效应因子产生，为优化实体瘤和血液肿瘤免疫治疗方案提供了新靶点。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，CAR-T细胞疗法虽在血液肿瘤中取得突破，但T细胞耗竭（exhaustion）和功能持久性不足仍是制约疗效的关键瓶颈。当T细胞遭遇持续抗原刺激时，会逐渐丧失杀伤能力并上调PD-1、LAG-3等抑制性受体，这种现象在实体瘤微环境中尤为显著。有趣的是，调控性T细胞（Treg）的核心转录因子FOXP3，近期被发现也能在常规T细胞激活后短暂表达，但其在CAR-T细胞中的功能仍属未知。柏林健康研究所的Lena Peter团队在《Molecular Therapy Methods》发表的研究，首次系统揭示了FOXP3作为CAR-T细胞"刹车分子"的作用机制。

研究人员采用非病毒CRISPR-Cas9编辑技术，在健康供体来源的CD19-CAR-T细胞中敲除FOXP3基因。通过流式细胞术、RNA测序和DNA甲基化芯片等技术，结合连续抗原刺激实验，发现FOXP3缺失能显著增强CAR-T细胞的效应功能而不加剧耗竭表型。

Lentiviral CAR delivery and CRISPR-Cas9-mediated FOXP3 knockout in T cells

研究团队建立了一套标准化流程：从健康供体PBMCs分选CD3⁺T细胞，经CD3/CD28抗体激活后，第1天用慢病毒转导CD19-CAR，第3天电递送FOXP3特异性sgRNA/Cas9核糖核蛋白复合物。实验设置四组对比：未编辑CAR组、FOXP3敲除（KO）CAR组及相应非CAR对照组。

FOXP3 knockout alters the phenotypic composition of CAR TCPs

流式分析显示FOXP3-KO使CAR-T细胞记忆亚群分布发生显著改变：CD4⁺区室中初始样细胞（T_NAIVE-LIKE）减少而效应记忆细胞（T_EM）增加；CD8⁺区室则呈现终末效应记忆细胞（T_EMRA）占比提升。这种分化趋势提示FOXP3缺失可能加速T细胞向效应表型转化。

FOXP3 knockout enhances CAR T cell functionality despite similar exhaustion marker profiles

在6轮连续抗原刺激实验中，FOXP3-KO组与对照组虽表现出相似的PD-1⁺LAG-3⁺TIM-3⁺三阳性耗竭细胞比例（10.9% vs 8.2%），但前者显示出更强的功能优势：CD154（CD40L）和CD137（4-1BB）激活标记显著上调，IFN-γ和TNF-α产量增加近2倍。尤为关键的是，FOXP3-KO细胞在连续杀伤实验中展现出更持久的细胞毒性。

讨论与意义

该研究首次阐明FOXP3在CAR-T细胞中的双重调控作用：虽然不直接诱导经典耗竭通路，但通过抑制NF-κB/RELA等转录因子活性，削弱效应功能。这一发现为克服T细胞功能障碍提供了新思路——通过精准调控FOXP3表达时空特征，既可避免传统耗竭标记物上调导致的治疗抵抗，又能增强细胞因子风暴风险可控的效应功能。研究还揭示了技术转化潜力：FOXP3编辑未引起表观遗传学改变，且与临床级CAR-T制备流程兼容。未来在实体瘤微环境或自身免疫病中的应用值得期待，但需关注CD25（IL-2Rα）表达降低可能影响的体内持久性。这项研究为开发下一代"抗耗竭"CAR-T产品奠定了分子基础。