基于GCN4表位插入与Rad51招募的Cas12a一体化核酸检测系统ECOT的优化与应用

（编辑推荐）本研究通过蛋白工程改造CRISPR-Cas12a系统，创新性地插入GCN4表位降低其顺式切割（cis-cleavage）活性，并利用scFv-Rad51增强反式切割（trans-cleavage）效率，开发出ECOT一体化检测平台。该系统可在30分钟内实现低至3拷贝/μL的HPV检测灵敏度，显著优于qPCR，为居家自检和临床诊断提供了高效工具。

　　

结构导向的Cas12a工程化改造

通过AlphaFold3结构分析，研究团队在LtCas12a的REC-II域（G372）和Nuc域（T1183）插入GCN4表位或Rad51，构建了四种变体。实验显示T1183位点插入显著降低顺式切割效率（CDKN2A靶点编辑效率从80%降至20%），而G372插入则保持原有活性。这种选择性抑制为后续一体化检测奠定了基础。

Rad51招募策略的信号放大机制

在反式切割实验中，Lt-T1183-GCN4与scFv-Rad51组合使荧光信号提升4.1倍（HPV16）和9.6倍（HPV18），而游离Rad51无此效果。冷冻电镜分析揭示，GCN4-scFv-Rad51三元复合物能将ssDNA报告分子富集在RuvC催化中心附近，形成"分子漏斗"效应。

从LtCas12a到LbCas12a的跨平台验证

该策略在LbCas12a中同样有效。在L371、C965位点插入GCN4后，配合subPAM crRNA使检测灵敏度达3拷贝/μL，较野生型提升8.3倍。临床样本测试显示，ECOT-Lb对HPV16/18的检出率高达96.7%，且与qPCR结果高度一致（R²>0.98）。

居家检测的工程化突破

通过优化RPA引物浓度（250 nM）、Mg²⁺（5 mM）和反应温度（42°C），ECOT系统在横向流动试纸条上实现30分钟可视化读值。与需要2小时的传统qPCR相比，其检测下限突破至3拷贝/μL，为宫颈癌早筛提供了革命性工具。

该研究开创性地将蛋白工程改造与核酸扩增检测耦合，通过精确调控Cas12a的双重切割活性，解决了CRISPR诊断中灵敏度与速度不可兼得的难题。ECOT平台的模块化设计为其他病原体检测提供了普适性蓝图。