综述：CRISPR/Cas工具在芸薹属作物抗逆性改良中的应用

这篇综述系统阐述了CRISPR/Cas（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）技术在芸薹属作物（Brassica）抗逆性改良中的前沿进展，重点解析了该技术通过靶向编辑病原体抗性基因（如NLRs、eIF4E）和胁迫响应通路（如ABA信号、HSFs、WRKYs）提升作物对生物胁迫（真菌、病毒、细菌）和非生物胁迫（干旱、盐碱、极端温度）的耐受性，为多倍体作物精准育种提供了创新策略。

　　

1 引言

芸薹属作物作为全球重要的油料和蔬菜来源，面临气候变化加剧带来的生物与非生物胁迫双重挑战。CRISPR/Cas系统凭借其高效、精准的特性，成为改良作物抗性的革命性工具。该技术通过靶向编辑关键基因（如eIF(iso)4E、BnaWRKY28）和调控元件，显著提升作物对真菌性病害（如菌核病）、病毒（TuMV）及极端环境的适应能力。多倍体基因组复杂性使得CRISPR在芸薹属中的应用更具挑战性，但近年基因组资源的丰富为靶点筛选提供了支撑。

2 生物胁迫抗性改良

2.1 真菌病害

靶向病原体毒力因子（如LmCBP1）或宿主易感基因（如RLK-902）的CRISPR编辑可显著增强抗性。例如，BnWRKY28敲除株系对菌核病抗性提升，而BnCAMTA3突变模拟了拟南芥中观察到的抗性表型。值得注意的是，CRISPR介导的SWEET15b编辑通过调控糖转运蛋白功能，使白菜对黑腐病的抗性指数降低39%。

2.2 细菌/原生生物

针对根肿病（Plasmodiophora brassicae），CRISPR成功将抗性基因Rcr1导入甘蓝型油菜，T₂代植株呈现稳定抗性。而BoBPM6/BoDMR6双敲除使花椰菜对镰刀菌枯萎病和根肿病的抗性显著增强，病害指数分别下降50.9%和33.1%。

2.3 病毒防御

RNA靶向的Cas13系统（如LshCas13a）通过切割TuMV的HC-Pro基因序列，在烟草中实现病毒载量降低。宿主因子编辑策略中，eIF(iso)4E突变使芸薹属作物完全抵抗TuMV侵染，且不影响生长发育。

3 非生物胁迫耐受机制

3.1 干旱响应

DELLA蛋白家族成员BnaA6.RGA的功能获得性突变通过调控ABA信号增强抗旱性。NF-YA7的M63I突变则通过抑制ABA诱导气孔关闭的负调控作用，使油菜在缺水条件下生物量增加42%。

3.2 盐碱与金属毒性

硼处理通过上调BnaA2.HKT1促进钠离子外排，而该基因敲除株系盐敏感性增强。重金属解毒方面，BnNRAMP1编辑使油菜镉积累量降低52-77%，且不影响必需微量元素吸收。

3.3 极端温度适应

热激蛋白调控网络是重要靶点，BrHSBP1编辑通过影响棉子糖生物合成增强耐热性。而AP2家族基因突变可纠正高温导致的萼片-心皮畸形，保障生殖发育。

4 现代育种整合策略

多组学分析（GWAS、QTL）加速抗性位点鉴定，如SRC06位点与菌核病抗性关联。针对多倍体冗余基因，多重编辑技术可同时靶向多个同源基因（如JAGGED家族），而CROPSR等算法优化了sgRNA设计效率。

5 CRISPR工作流程优化

从载体构建（U6启动子驱动sgRNA）到递送系统（农杆菌转化、PEG介导原生质体转染），各环节持续改进。中国团队开发的pEC细胞特异性启动子使编辑效率提升30倍，而病毒载体（TRV）可实现sgRNA的瞬时高效表达。

6 结论与展望

尽管基因型依赖的再生难题仍存，CRISPR技术已在芸薹属抗逆育种中展现出变革潜力。未来需结合单细胞测序等新技术深化多倍体基因组解析，并建立更高效的递送体系，以应对气候变化下的粮食安全挑战。