蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803中RNase J参与CRISPR RNA成熟的机制研究及其在细菌免疫防御中的意义

本研究揭示了蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803中RNase J与RNase E协同参与III-Bv型CRISPR-Cas系统crRNA成熟的新机制。通过Co-IP和体外酶切实验，发现RNase J通过5'-3'外切和内切活性切割crRNA前体，而PNPase虽与RNase J互作但不参与成熟过程。该研究拓展了细菌RNA降解体与CRISPR免疫系统的关联认知，为原核生物适应性免疫的进化研究提供新视角。

　　

在细菌与古菌的生存竞争中，CRISPR-Cas系统作为RNA介导的适应性免疫机制，通过向导RNA（crRNA）识别并切割外来遗传物质。然而，不同CRISPR亚型的crRNA成熟机制存在显著差异：部分系统依赖Cas6核酸内切酶，而另一些则利用宿主RNA降解机器如RNase E或RNase III。蓝藻模型生物Synechocystis sp. PCC 6803具有三个CRISPR系统，其中III-Bv型（CRISPR3）缺乏Cas6，已知依赖RNase E产生13/14 nt的5'端重复序列，但3'端成熟机制仍不明确。这一空白领域引发了对其他核糖核酸酶潜在作用的探索。

为解析CRISPR3系统的完整成熟通路，Raphael Bilger等团队聚焦于兼具内切与5'-3'外切活性的RNase J。该酶在细菌中广泛存在却研究较少，其与RNase E的协同机制可能构成crRNA加工的关键环节。研究通过构建RNase J敲降株（δrnj）和过表达株，结合体外酶切、Northern杂交和引物延伸实验，首次证实RNase J在crRNA成熟中的功能：在体内，δrnj株积累+1/+3 nt的5'端切割产物；体外实验显示RNase J在CRISPR重复序列茎环下游2 nt处切割，与RNase E的切割位点相邻。Co-IP质谱分析发现PNPase与RNase J强互作，但体外活性实验排除了其对crRNA成熟的直接贡献。这些发现完善了"两步加工"模型：RNase J起始切割后，RNase E完成5'端成熟，最终形成48 nt和42 nt的两种功能性crRNA。

关键技术方法包括：1）铜诱导启动子构建RNase J过表达系统；2）CRISPR3 crRNA的Northern杂交与引物延伸定位切割位点；3）重组RNase J和PNPase的体外RNA切割活性检测；4）基于FLAG标签的Co-IP与质谱互作蛋白筛选。

RNase J参与CRISPR3 crRNA成熟

通过δrnj株的引物延伸分析，发现+1/+3 nt处积累的5'端片段（图2），证实RNase J参与早期加工。Northern杂交显示过表达株中70 nt中间体消失（图3），暗示其5'外切活性增强。体外实验进一步揭示RNase J切割合成CRISPR重复序列产生35 nt片段（图1A），与RNase E的13/14 nt切割形成互补模式。

RNase J互作组特征

Co-IP鉴定出8个共同富集蛋白（表1），包括PNPase（log₂FC>4.5）和调控因子EbsA、PisG等。AlphaFold预测RNase J的C端精氨酸富集区（RRSRKRS）可能介导PNPase结合（图S4），但该互作在crRNA成熟中非必需。

PNPase的排除性验证

尽管PNPase展现强3'外切活性（图5），其降解CRISPR重复序列时在茎环处受阻，且不影响成熟crRNA积累，排除了其在CRISPR3加工中的直接作用。

研究结论指出，RNase J与RNase E的协同作用完善了III-Bv型CRISPR系统的crRNA成熟通路（图6），首次将β-CASP家族核糖核酸酶与细菌免疫关联。该发现拓展了RNA降解体功能多样性认知，为CRISPR-Cas系统进化分化的机制研究提供新思路。讨论部分强调，RNase J可能通过其双功能活性整合转录后调控与免疫防御，而保守的Slr0552相邻基因暗示存在未知调控网络。这些成果发表于《microLife》，为原核生物RNA代谢与免疫交叉领域奠定重要基石。