新型遗传工具包开发：诱导型基因表达与CRISPRi技术在专性捕食细菌Bdellovibrio bacteriovorus中的应用突破

本研究针对专性捕食细菌Bdellovibrio bacteriovorus遗传操作工具匮乏的难题，开发了包含IPTG诱导表达系统和CRISPRi基因敲降模块的新型工具箱。通过系统评估启动子强度、建立跨生长周期诱导体系，并成功靶向细胞分裂基因ftsZ和形态基因bd1075，首次实现捕食周期关键基因的动态调控，为解析非经典细胞周期与捕食行为的分子机制提供关键技术支撑。

　　

在微生物世界的隐秘角落，存在一类独特的"细菌猎手"——Bdellovibrio bacteriovorus（以下简称Bd）。这种专性捕食细菌具有令人惊叹的生存策略：它侵入革兰氏阴性细菌的周质空间，经历从攻击期（AP）到生长期（GP）的复杂发育周期，最终通过非二元分裂产生多个子代。然而，这种特殊生活史也带来研究困境——许多关键基因的缺失会导致捕食能力丧失，而传统诱导表达系统在该菌中效果不佳。

为突破这一技术瓶颈，Charles de Pierpont团队在《microLife》发表的研究中，构建了迄今最完善的Bd遗传操作工具箱。研究人员首先系统评估了9种启动子（包括P_rhoBb、P_tac等）的驱动强度，发现合成启动子P_Biofab和改造型P_tac分别适合组成型和诱导型表达。创新性地将lacI阻遏蛋白与P_tac启动子组合，首次实现攻击期和生长期双阶段的IPTG诱导控制，荧光报告基因tdTomato表达量可随诱导剂浓度梯度升高50倍。

关键技术突破在于构建可诱导CRISPRi系统：将来自Streptococcus pasteurianus的失活Cas9（dCas9_Spa）置于P_tac控制下，配合组成型表达的sgRNA。该系统成功再现了bd1075基因敲除的直杆表型（细胞曲率降低40%），并首次揭示细胞分裂蛋白FtsZ在Bd中的必需性——诱导敲降导致30%子代细胞异常伸长，但有趣的是这些丝状体仍能脱离猎物，表明细胞分裂与捕食周期存在可解耦性。

研究方法上，团队采用：① 启动子强度定量分析（基于sfGFP荧光显微成像）；② 双交叉同源重组构建染色体整合株；③ 微孔板捕食动力学监测（SYBR Green标记法）；④ 单细胞形态定量（Oufti软件分析）。实验使用Bd野生型HD100菌株和大肠杆菌MG1655猎物体系。

研究结果可分为三部分：

1. 1.

   启动子强度图谱：通过单细胞荧光分析绘制启动子效率排序，P_trc表达最强（达P_rptI的8倍），而P_lacIq完全失活，为工具选择提供基准。

2. 2.

   诱导系统开发：

   

   P_tac-tdTomato在1mM IPTG诱导下，荧光信号较本底提升58倍，且不影响捕食效率（r_max=0.25 h^-1）。

3. 3.

   CRISPRi应用验证：

   

   靶向ftsZ的sgRNA导致细胞长度分布右移（均值从1.53μm增至2.12μm），首次证明该菌分裂依赖FtsZ，但丝状体仍具猎物逃逸能力，揭示发育程序的弹性。

这项研究的意义在于：① 提供首个可逆、快速基因敲降工具，克服了必需基因研究的障碍；② 揭示捕食行为与细胞周期调控的可分离性；③ 为探究细菌非经典分裂机制建立技术范式。Géraldine Laloux团队开发的工具箱将推动捕食细菌在生物防治、微生物互作等领域的应用探索，也为其他难培养微生物的遗传操作提供借鉴。