揭示人源跨损伤DNA聚合酶REV1与PCNA相互作用的结构基础及其在DNA损伤修复中的关键作用

本研究通过X射线晶体学技术首次解析了人源跨损伤DNA聚合酶REV1与增殖细胞核抗原(PCNA)的复合物结构，鉴定出REV1中保守的PCNA结合基序（PIP-box变体1110-QKLIDGFL-1117），解决了长期以来关于REV1-PCNA物理相互作用的争议，为理解跨损伤DNA合成(TLS)的分子机制提供了重要结构基础。

　　

DNA复制是细胞增殖和生存的基本过程，但在复制过程中遇到模板链损伤时，高保真DNA聚合酶会停滞。这时就需要低保真的跨损伤DNA合成(TLS)聚合酶来"救场"，其中Y家族DNA聚合酶REV1因其独特的脱氧胞苷转移酶活性和支架蛋白功能而备受关注。然而，REV1如何与DNA滑动钳PCNA相互作用这一关键问题，多年来存在诸多争议——小鼠实验表明N端BRCT结构域参与结合，酵母研究显示PAD结构域也能相互作用，但人类细胞实验却得出了不同结论。这种混乱局面严重阻碍了对TLS分子机制的理解。

来自日本静冈县立大学药学院的Asami Hishiki团队在《The Journal of Biochemistry》发表的研究，综合运用了蛋白质下拉实验、差示扫描荧光法(DSF)和X射线晶体学技术。研究人员首先通过序列比对在REV1的C端区域发现了一个保守的疑似PIP-box序列，随后构建了包含该区域的REV1(933-1140)片段进行下拉实验验证。关键残基突变实验和DSF热稳定性分析证实了该基序与PCNA的特异性结合。最终通过2.7?分辨率的晶体结构解析，直观展示了REV1 PIP-box与PCNA的相互作用模式。

研究结果部分，"Identification of a PCNA-binding motif in human translesion DNA polymerase REV1"显示，通过序列比对在脊椎动物REV1中鉴定出一个保守的PCNA结合特征序列1110-QKLIDGFL-1117。下拉实验证实该区域确实介导了REV1与PCNA的结合，关键残基Gln1110、Ile1113、Phe1116和Leu1117的丙氨酸突变显著削弱了这种相互作用。

"Structural analysis of the interaction between the REV1 PIP-box and PCNA"部分，2.7?分辨率的晶体结构显示REV1肽段结合在PCNA每个亚基的IDC环邻近口袋中。Gln1110侧链插入Q口袋形成氢键网络；Ile1113、Phe1116和Leu1117形成三叉疏水栓，其中Ile1113和Leu1117深入IDC环侧面的深腔，Phe1116则与浅凹面接触。特别值得注意的是，REV1 PIP-box第八位的亮氨酸与其他Y家族聚合酶一样采取了非经典构象。

"Comparison of PCNA-binding motif structures"比较发现，REV1 PIP-box中第八位的亮氨酸与Pol κ、Pol ι和TRAIP等蛋白的PCNA结合基序中的相应残基构象相似，这种构象可能是脂肪族侧链在该位置的普遍特征。与APIM基序的对比也显示了类似的结合机制。

研究结论指出，这项工作不仅解决了REV1-PCNA相互作用的长久争议，还揭示了REV1通过C端小指结构域后的PIP-box变体与PCNA结合的分子机制。这种相互作用虽然亲和力较低，但在PCNA单泛素化后可能通过邻近的UBM2结构域增强，从而促进TLS过程。研究建立的REV1-PCNA-DNA作用模型为理解TLS中多聚合酶协同工作机制提供了结构框架。鉴于REV1在多种癌症中的重要作用，这些发现也为开发靶向TLS的抗癌药物提供了新思路。