基于CRISPR-Cas13a联合RT-ERA的蓝舌病毒快速精准检测技术研发及现场应用评估

本文创新性开发了整合逆转录酶促重组酶扩增（RT-ERA）与CRISPR-Cas13a的蓝舌病毒（BTV）现场检测平台，实现55分钟内20拷贝/反应的灵敏度，通过荧光值、荧光信号和侧流层析试纸条三重判读模式，在263份临床样本中验证了96-100%的临床敏感性和100%特异性。该系统突破传统RT-qPCR对精密仪器的依赖，首次建立覆盖30种BTV血清型的CRISPR检测方案，为资源有限地区的动物疫病监测提供革新性技术手段。

　　

引言：

蓝舌病毒（BTV）作为影响反刍动物的重要虫媒病原体，其传统的RT-qPCR检测方法受限于设备依赖性和耗时性。本研究突破性开发了整合逆转录酶促重组酶扩增（RT-ERA）与CRISPR-Cas13a的检测平台，通过三重判读模式实现BTV的现场快速检测。该病毒具有10节段双链RNA基因组，已发现36个血清型，其中BTV-3在2023年欧洲爆发导致42,929例病例，而中国虽无疫情但检出多种血清型抗体，凸显建立现场检测技术的紧迫性。

材料与方法：

研究采用哈尔滨兽医研究所提供的灭活病毒及临床样本，针对BTV S1-S10节段设计crRNA混合物和RT-ERA引物。系统优化包括：筛选S1靶向crRNA（含crRNA1-3混合物），确定75ng Cas13a蛋白和1μM crRNA的最佳浓度，并通过引物交叉验证选定F2/R5引物对。检测流程包含40°C 20分钟RT-ERA扩增，37°C 20分钟CRISPR-Cas13a反应，支持荧光仪、蓝光成像系统和侧流试纸条三种读值方式。现场模拟采用核酸释放试剂（NARR）直接裂解样本，省略核酸纯化步骤。

结果：

灵敏度测试显示系统可稳定检出20拷贝/反应的BTV RNA，较传统方法提升10倍。特异性验证证实与EHDV、AKAV等9种病原体无交叉反应。血清型覆盖评估显示可检测30种BTV血清型，包括存在单碱基错配的BTV-6/-14等毒株。263份临床样本验证中，荧光检测实现100%敏感性（80/80），试纸条法达96%（77/80），NARR预处理保持97%敏感性（78/80）。值得注意的是，该系统在未纯化样本中仍保持100%特异性。

讨论：

该研究首创的CRISPR-Cas13a检测平台突破三大技术瓶颈：1）灵敏度媲美RT-qPCR但耗时缩短83%；2）通过S1靶向设计实现广谱血清型覆盖；3）NARR预处理使现场检测成本降低40%。虽然当前检测成本略高于常规PCR（3.69美元/测试），但其设备独立性显著提升基层适用性。未来可通过T7聚合酶国产化进一步降低成本，并开发多靶点检测体系应对病毒变异。该技术为动物疫病防控提供"样本进-结果出"的解决方案，对保障畜牧业生产和公共卫生安全具有重要实践价值。