中性粒细胞弹性蛋白酶通过促进低分子量细胞周期蛋白E1形成加速骨肉瘤增殖的机制研究

本研究揭示了中性粒细胞弹性蛋白酶（ELA2）通过切割全长细胞周期蛋白E1（FL-cyclin E1）生成低分子量亚型（LMW-cyclin E1），进而促进骨肉瘤（OS）恶性进展的新机制。研究发现肿瘤相关中性粒细胞（TANs）及其诱发的 neutrophil extracellular traps（NETs）是ELA2的主要来源，靶向该通路可显著抑制OS增殖，为免疫治疗提供了新策略。

　　

Introduction

骨肉瘤（OS）作为儿童青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，其标准治疗方案近40年未取得突破性进展。既往研究发现细胞周期蛋白E1（cyclin E1）在OS中异常高表达，但mRNA水平与预后无显著关联，提示存在转录后调控机制。本研究首次在OS中鉴定出33-47 kDa的低分子量cyclin E1亚型（LMW-cyclin E1），该亚型特异性定位于细胞质，与患者不良预后显著相关。

Materials and methods

研究团队通过免疫组化（IHC）分析69例原发OS样本发现，胞质cyclin E1高表达组5年生存率较对照组降低37%。Western blot证实LMW-cyclin E1在8例OS组织中普遍存在。利用共培养体系、流式分选等技术，发现OS细胞可诱导中性粒细胞形成NETs，释放ELA2。动物实验采用BALB/c小鼠皮下成瘤模型，通过抗Ly6G抗体清除中性粒细胞验证其促瘤作用。

Results

机制研究表明：

1. 1.

   蛋白酶筛选：共免疫沉淀（Co-IP）显示ELA2可直接结合cyclin E1，而钙蛋白酶（calpain 1/2）虽调控FL-cyclin E1表达但不参与切割。在U2OS（ALT依赖型）和143B（端粒酶阳性）细胞中，calpain呈现相反调控作用，反映OS亚型异质性。

2. 2.

   ELA2功能：过表达ELA2使LMW-cyclin E1增加2.1倍，下游RB蛋白磷酸化（p-RB）水平升高，加速G1/S期转换（S期细胞比例增加18%）。

3. 3.

   中性粒细胞作用：接触式共培养24小时后，OS细胞中ELA2表达提升3.5倍。临床样本显示肺转移灶中性粒细胞浸润密度较原发灶高2.3倍（p<0.01），且与ELA2表达呈正相关（r=0.67）。

4. 4.

   NETs机制：OS细胞诱导NETs形成，使NETs浓度从6.65 ng/ml升至48.9 ng/ml。抑制剂GSK484可逆转NETs促增殖效应，使细胞活力下降42%。

Discussion

该研究创新性提出"OS细胞-NETs-ELA2-LMW-cyclin E1"正反馈环路：OS细胞招募中性粒细胞并诱导NETs释放ELA2，后者被肿瘤细胞摄取后促进LMW-cyclin E1生成，进而驱动细胞周期进展。靶向该通路的小分子抑制剂AZD9668（50 nM）可显著抑制肿瘤生长（体积减少58%），但需注意calpain在端粒酶阳性亚型中可能存在的代偿效应。未来研究可结合单细胞测序进一步解析中性粒细胞亚群在OS微环境中的动态变化。