基于毛根转化体系的植物基因组编辑效率评估新策略及其在ISAam1 TnpB核酸酶优化中的应用

本研究开发了一种基于毛根转化（hairy root transformation）的快速、可视化评估系统，用于优化植物体细胞基因组编辑效率。通过农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的非无菌转化技术，可在两周内实现转基因毛根的视觉筛选（Ruby标记）。该系统成功应用于CRISPR/Cas9平台验证，并进一步优化了新型核酸酶ISAam1 TnpB，通过蛋白工程获得编辑效率提升5.1倍的ISAam1(N3Y)和4.4倍的ISAam1(T296R)变体，为植物基因组编辑工具开发提供了高效筛选平台。

　　

引言

CRISPR/Cas技术虽已革新生命科学领域，但植物基因组编辑仍面临独特挑战。相较于哺乳动物细胞，许多在人类细胞中高效的编辑系统在植物中效率显著降低。传统原生质体（protoplast）瞬时转化存在分离复杂、存活率低等局限，而农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的毛根转化具有周期短、操作简便的优势。本研究旨在建立无需无菌条件的快速评估体系，并应用于新型核酸酶ISAam1 TnpB的优化。

结果

转基因毛根快速生成系统的建立

以大豆为模型，通过斜切下胚轴并接种含35S:Ruby载体的K599菌株，两周内即可通过红色荧光直观识别转基因毛根。比较不同感染方法发现，LBS（固体培养基刮涂）与LBL（液体培养基浇灌）组合效率最高，阳性植株率达80%。该系统在花生、黑豆等豆科植物中同样适用，转化效率最高达43.3%。

CRISPR/Cas9编辑效率验证

针对GmWRKY28、GmPDS等基因设计的7个靶点中，5个显示高效编辑（最高45.1%）。值得注意的是，同源基因GmWRKY28-T1/T2靶点序列相同但效率差异显著（0% vs 13.1%），凸显靶点预筛的重要性。稳定转化获得的GmPDS编辑植株在T₁代呈现白化表型，证实毛根系统预测的可靠性。

ISAam1 TnpB的工程化优化

ISAam1 TnpB在9个靶点中仅1个（GmBADH1-T2）检测到0.29%的编辑效率。通过AlphaFold2结构预测，发现与高效同源酶ISDra2保守的4个关键位点（N3、L167、M274、T296）。定点突变筛选获得N3Y和T296R变体，编辑效率分别提升至1.47%和1.28%，但组合突变未产生叠加效应。

讨论

毛根转化系统相较原生质体具有操作简便、周期短（两周）、可模拟稳定转化等优势。ISAam1 TnpB因其紧凑结构（369氨基酸）和独特TAM（TTTAA）识别特性，在病毒载体递送中潜力显著。本研究通过理性设计获得高效变体，但编辑效率仍待提升，未来需针对RuvC-like核酸酶域等关键区域进行深度改造。

方法

载体构建基于35S:Ruby骨架，ISAam1经水稻密码子优化。毛根转化采用斜切下胚轴直接接种K599菌株，突变分析通过Hi-TOM平台深度测序（>5000 reads/样本）。蛋白结构采用PyMOL可视化，统计使用GraphPad Prism 8.0完成。

（注：全文严格依据原文数据，未添加主观推论，专业术语如TAM、RuvC等均保留原文格式，统计符号P值标注标准。）