利用2A肽的FaBody平台解决IgG样双特异性抗体的轻链错配问题

双特异性抗体(BsAbs)开发面临轻链(LC)错配难题，RemeGen团队创新性提出基于2A肽的FaBody平台。研究通过引入自切割2A肽（F2A/P2A/E2A/T2A）结合弗林蛋白酶(furin)共转染，显著提升IgG样BsAbs的正确组装效率（产量达235.8 mg/L），并验证T2A-RRKR组合在稳定性（Tm=73.5°C）、功能性和低免疫原性方面的综合优势。该研究为BsAbs药物开发提供了高效生产新策略，发表于《Biotechnology Reports》。

　　

在生物医药领域，双特异性抗体(Bispecific antibodies, BsAbs)因其能同时靶向两个不同抗原或表位的特性，成为肿瘤和自身免疫疾病治疗的新宠。然而，这类"双靶向导弹"的制造过程却面临着一个棘手难题——轻链(Light chain, LC)与重链(Heavy chain, HC)的"配对错误"。就像组装乐高积木时拿错了零件，这种错配会导致抗体结构异常、功能丧失。更麻烦的是，传统单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAbs)的生产工艺无法直接套用于BsAbs，使得目前全球获批的BsAbs药物寥寥无几。

RemeGen公司的研究团队独辟蹊径，从自然界中寻找灵感。他们注意到，口蹄疫病毒(FMDV)中的2A肽具有神奇的"自剪裁"特性——这个仅19-22个氨基酸的小片段能在翻译过程中自动断裂，使一条mRNA能产生多个独立蛋白。团队设想：能否将这种"分子剪刀"应用于BsAbs生产，精确控制轻链与重链的配对？

研究团队开发了名为FaBody（Furin-2A-Mediated bispecific Antibody Generation Platform）的创新平台。该平台巧妙地将2A肽与弗林蛋白酶(furin)识别序列结合，通过在抗体Fab区域两端插入这段"智能连接器"，利用2A肽的自切割特性实现轻链的精准定位。就像给装配线加装智能机械臂，这套系统能显著减少"错装零件"的概率。

关键技术方法包括：采用ESMFold软件预测蛋白结构，HEK293SQ哺乳动物细胞表达系统进行瞬时转染，结合HPLC-SEC（高效液相色谱-尺寸排阻色谱）和质谱分析评估组装效率，通过表面等离子共振(SPR)和ELISA检测抗原结合活性，并运用AlphaMHC和WeADApt算法预测免疫原性风险。

研究结果方面：

1. 1.

   2A肽对双特异性抗体表达的影响

   比较F2A、(GGGGS)n等6种连接方式发现，对称设计的d-F2A结构产量最高（235.8 mg/L），非还原SDS-PAGE显示其正确组装率达86.36%。有趣的是，2A肽介导的抗体与常规(GGGGS)n连接体相比，保持了相当的HER2/cMet结合活性。

2. 2.

   抗体构建体的表征

   热稳定性测试显示d-F2A的Tm值达62.6°C，显著优于对照组。质谱分析证实存在17对二硫键（5对链间、12对链内），但轻链C端残留RAKR等氨基酸，提示需优化切割效率。

3. 3.

   弗林共转染提升切割效率

   调整HC:LC:furin转染比例至1:1:2时，残留完整连接器的比例降至3%。将识别序列从RAKR改为RRKR后，最大残留氨基酸从4个减至3个，其中d-T2A RRKR表现最优。

4. 4.

   不同2A肽比较

   四类2A肽中，T2A在产量（54.41 mg/L）、纯度（>50%）、Tm值（73.5°C）等指标均衡，且免疫原性风险最低。Western blot显示d-F2A RRKR对磷酸化cMet的抑制效果最佳。

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   FaBody平台的广泛应用

   该平台成功构建了CD3/CD20（κ-κ型）、CD3/GPC3（κ-λ型）、EGFR/PD-L1（λ-λ型）三种BsAbs，其中CM350-T2AR的Tm值较母本抗体显著提升，证实平台适配不同轻链组合。

这项研究的意义在于：首次系统评估了2A肽在BsAbs生产中的综合性能，建立了"自切割连接器+外源蛋白酶"的双重质量控制体系。特别是发现T2A-RRKR组合兼具高效切割（furin效率达98.4%）和低免疫原性的特点，为工业化生产提供了优选方案。相比现有技术（如elg、HOT-Ig等），FaBody平台引入的外源序列更少，且能保持抗体天然结构，这对推动BsAbs从实验室走向临床具有重要价值。未来通过构建furin稳定表达细胞株，或能进一步消除残余氨基酸，使这一"智能装配线"更加完美。