基于猪内源性逆转录病毒逆转录酶的高效哺乳动物基因组碱基编辑系统pvPE的开发及其在阿尔茨海默病猪模型构建中的应用

本研究针对现有碱基编辑系统效率不足的问题，开发了基于巴马小型猪内源性逆转录病毒逆转录酶(PERV-RT)的新型高效碱基编辑系统pvPE。通过RT工程改造、结构优化和La蛋白融合等策略，将编辑效率提升24.38-101.69倍，结合微管抑制剂Nocodazole处理可进一步提高效率。利用该系统成功构建了同时携带APPKM652/653NL、PSEN1M143L和TAUP300L突变的三基因编辑阿尔茨海默病(AD)猪模型，为疾病机制研究和药物开发提供了重要平台。

　　

基因组编辑技术正在彻底改变生命科学研究，但现有工具仍面临效率与精度的双重挑战。在众多编辑技术中，碱基编辑(Prime Editing, PE)因其无需双链断裂且能实现精准点突变的优势备受关注，但其核心组件逆转录酶(Reverse Transcriptase, RT)的效率瓶颈制约了应用。目前大多数PE系统依赖鼠白血病病毒(MMLV)来源的RT，而自然界中是否存在更高效的RT资源尚未充分探索。与此同时，阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)等复杂疾病研究迫切需要能模拟人类病理特征的大型动物模型，但传统方法难以实现多基因协同编辑。

为解决这些关键问题，刘为伟团队从中国特有的巴马小型猪基因组中挖掘出猪内源性逆转录病毒(Porcine Endogenous Retrovirus, PERV)的逆转录酶资源，通过系统性工程改造，开发出性能卓越的pvPE编辑系统。研究首先从205个PERV-RT序列中筛选出高活性变体Bama_C1-RT，随后通过引入D199N/T305K/W312F/L602W/V222A/Y63R/C408R七个关键突变获得pvPE-V2，编辑效率较初始版本提升38.6%。进一步融合病毒核衣壳蛋白(Nucleocapsid, NC)并删除RNase H结构域形成的pvPE-V3，在猪胎儿成纤维细胞(Porcine Fetal Fibroblasts, PFFs)中实现最高11.62倍的效率提升。

研究创新性地发现微管抑制剂Nocodazole(Noc)可通过下调错配修复(Mismatch Repair, MMR)通路关键基因EXO1、MSH3等，使编辑效率平均提高2.25倍。转录组分析揭示Noc处理还激活MAPK信号通路，可能通过改变染色质开放性协同增强编辑效果。将La蛋白与pvPE-V3融合形成的pvPE-V4系统，在HEK293T细胞中效率达到PE7的2.39倍，且副产物显著减少。

关键技术方法包括：1)从巴马小型猪等5个猪种分离PERV-RT序列并进行系统发育分析；2)采用Phyre2和AlphaFold3进行蛋白结构预测与理性设计；3)通过荧光报告系统和深度测序评估编辑效率；4)利用RNA-seq解析Noc的作用机制；5)结合体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT)制备基因编辑猪。

研究结果部分：

1. 1.

   筛选高活性PERV-RT：通过GFP报告系统比较86种PERV-RT变体，发现Bama_C1-RT构建的pvPE-V1效率显著优于PE1，在Tau和P53位点与PE2相当。

2. 2.

   RT工程改造：基于结构模拟的Y63R和C408R突变使RNA/DNA结合稳定性增强，七突变体pvPE-V2效率提升38.6%。

3. 3.

   结构优化：融合NC蛋白并删除RNase H的pvPE-V3在PFFs中效率达PE7的1.47倍，且副产物减少。

4. 4.

   小分子增效：Noc通过下调MMR通路基因使pvPE-V3在PFFs中效率提升1.29倍，细胞周期分析证实其诱导G2/M期阻滞。

5. 5.

   多基因编辑应用：pvPE-V3-Puro+Noc系统在PFFs中实现APP^KM652/653NL(92.2%)、PSEN1^M143L和TAU^P300L三基因同步编辑，获得34头克隆猪。

6. 6.

   AD模型验证：10月龄3xTg-AD猪脑脊液中Aβ42/40比值显著升高，海马组织Tau蛋白Ser396位点磷酸化水平增加，重现AD核心病理特征。

7. 7.

   La蛋白融合：pvPE-V4在PFFs中效率较pvPE-V1提升101.69倍，且与epegRNA联用无额外增益，显示La已充分稳定pegRNA。

这项研究开创性地将猪源逆转录酶应用于基因组编辑，突破了现有PE系统的效率限制。pvPE系统在跨物种兼容性、多基因编辑能力和精准度方面的优势，为农业育种和生物医学研究提供了全新工具。所构建的3xTg-AD猪模型首次在大型动物中同时模拟Aβ异常沉积和Tau病理，填补了AD研究领域的关键技术空白。技术层面，研究揭示了PERV-RT的分子进化特征，建立了RT工程改造的通用策略，发现的Noc增效机制为编辑效率调控提供了新思路。随着递送系统和安全性评估的完善，pvPE系统有望在基因治疗、精准育种等领域产生深远影响。