多重代谢工程结合适应性进化策略提升解脂耶氏酵母高产琥珀酸的生物合成效率

针对传统化学合成琥珀酸高能耗、高污染问题，研究人员通过多重代谢工程（弱化Sdh活性、减少副产物积累、强化琥珀酸合成途径）结合适应性实验室进化（ALE），构建了解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）工程菌株。该菌株以甘油为底物时，在非pH调控条件下琥珀酸产量达130.99 g/L（产率0.35 g/g）；通过转运蛋白工程和适应性进化进一步优化葡萄糖利用，进化菌株ST-112在5-L生物反应器中产量达106.68 g/L。转录组分析揭示了酪氨酸降解途径中4-Hppd对Sdh缺陷菌株葡萄糖利用的恢复作用，为琥珀酸生物制造提供了新思路。

　　

琥珀酸作为一种重要的平台化合物，在可降解材料、医药和食品工业中应用广泛。然而，传统化学合成法存在高能耗和环境污染问题，而微生物发酵法虽环保却面临产量和效率瓶颈。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）因其卓越的耐酸性和成熟的遗传工具成为理想宿主，但通过失活琥珀酸脱氢酶（Sdh）阻断TCA循环的策略会导致菌株葡萄糖利用能力严重受损。如何突破这一限制，实现高效琥珀酸生物合成，成为研究者亟待解决的难题。

为攻克这一挑战，Tao Sun等团队在《Technovation》发表研究，通过多重代谢工程与适应性进化（ALE）的协同策略，系统优化了解脂耶氏酵母的琥珀酸合成路径。研究首先通过弱化Sdh5活性（基因敲除或启动子截断）阻断琥珀酸降解，发现ΔSdh5菌株ST-101能以甘油为底物产生2.49 g/L琥珀酸，但伴随乙酸积累。随后通过敲除乙酰-CoA水解酶（Ach1）减少副产物、过表达丙酮酸羧化酶（PYC）并敲除磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PCK）增强前体供应，使产量提升至7.71 g/L。进一步引入胞质型异柠檬酸裂解酶（ICL）和苹果酸合酶（MLS），构建的ST-109菌株在5-L生物反应器中产量达130.99 g/L，产率0.35 g/g。

针对葡萄糖利用障碍，研究创新性结合转运蛋白工程（表达裂殖酵母来源的C4-二羧酸转运蛋白SpMAE1）和梯度浓度葡萄糖适应性进化（30-150 g/L），获得消除生长延滞期的进化菌株ST-111。转录组分析发现，酪氨酸降解途径关键酶4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（4-Hppd）表达显著上调，其通过激活磷酸戊糖途径（HMP）和提供TCA循环中间产物（延胡索酸和乙酰-CoA），部分恢复了Sdh缺陷菌株的葡萄糖代谢能力。最终敲除二羧酸转运蛋白Jen1的菌株ST-112在pH 5.5控制的5-L生物反应器中实现106.68 g/L琥珀酸产量。

关键技术包括：1）基因编辑（CRISPR-Cas9介导的Sdh5、Ach1等基因敲除）；2）多基因组合表达（PYC、SCS2等途径强化）；3）适应性进化（梯度葡萄糖压力筛选）；4）转录组测序（Illumina平台分析ST-110与ST-111差异基因）；5）生物反应器发酵优化（pH和底物补料控制）。

研究结果分五部分呈现：

1. 1.

   弱化Sdh活性促进琥珀酸积累：ΔSdh5菌株ST-101以甘油为底物产量最高（2.49 g/L），但伴随乙酸积累导致生长抑制。

2. 2.

   代谢途径优化提升合成效率：通过消除副产物、增强前体供应和引入胞质型ICL-MLS途径，ST-109产量提升至130.99 g/L。

3. 3.

   转运工程与适应性进化协同作用：SpMAE1表达结合ALE获得的ST-111显著缩短葡萄糖利用延滞期，产量达15.39 g/L。

4. 4.

   进化菌株转录组解析：4-Hppd通过激活HMP途径和提供TCA中间体，缓解Sdh缺陷导致的代谢失衡。

5. 5.

   5-L生物反应器验证：ST-112在pH调控下实现106.68 g/L产量，证实进化策略的工业适用性。

该研究不仅创了解脂耶氏酵母琥珀酸生产的最高纪录，更揭示了4-Hppd在碳代谢重编程中的新功能，为理性设计高效细胞工厂提供了理论依据。通过将定向进化与系统生物学相结合，突破了传统代谢工程对复杂表型改造的局限，为生物基化学品的绿色制造树立了范式。尤其值得注意的是，研究中发现的HMP途径与酪氨酸降解的协同机制，为需NADPH供能的次级代谢产物生产提供了普适性策略。