基于多重荧光核酸探针与STORM成像的单分子生物传感器检测汉坦病毒研究

本文创新性地将多重荧光核酸探针与随机光学重构显微技术（STORM）相结合，开发出检测限低至57.54 aM的汉坦病毒RNA单分子检测平台。通过PCR掺入EdUTP和点击化学实现多位点Cy5荧光标记，突破传统单荧光探针灵敏度瓶颈，为出血热肾病综合征（HFRS）早期诊断提供新策略。

　　

亮点

多重荧光核酸探针的合成

首先将87.30 μL DEPC水、10.00 μL 10×PCR缓冲液、0.20 μL dATP（100 mM）、0.20 μL dGTP（100 mM）、0.20 μL dCTP（100 mM）、0.40 μL 5-EdUTP（50 mM）、0.50 μL正向引物1、0.50 μL反向引物2、0.20 μL模板1和0.50 μL Taq DNA聚合酶混合进行100μL体系PCR扩增。反应条件为95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 15秒，共40个循环，最后72°C延伸5分钟完成扩增。PCR产物经乙醇纯化后备用。

生物传感器的构建

本研究方案分为三个主要部分（如方案1所示）。首先利用炔基与叠氮基团的铜催化环加成反应合成多重荧光核酸探针作为信号探针。通过PCR过程中用5-EdUTP核苷酸类似物替代2'-脱氧胸苷5'-三磷酸（dTTP），合成带有多个炔基修饰的DNA双链。随后采用λ外切酶消化获得单链DNA探针，并通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）将含叠氮基团的Cy5荧光染料标记到探针上。

结论

针对当前汉坦病毒（HTNV）检测方法的局限性，我们开发了基于多重荧光核酸探针结合靶链置换反应的单分子荧光检测平台，用于直接检测HTNV RNA。该系统成功实现了单分子荧光定位成像技术在疾病早期诊断中的应用。通过点击化学在DNA探针上标记多个荧光基团，我们显著提升了检测灵敏度。