假单胞菌非常规过氧化物酶DypB3152的分泌机制：T6SS与OMVs协同驱动木质素降解的碳获取策略

本研究揭示了假单胞菌Pseudomonas putida A514中缺乏信号肽的木质素降解酶DypB3152的跨膜分泌机制。研究人员通过蛋白质组学、基因敲除和共免疫沉淀等技术，首次发现VI型分泌系统（T6SS）通过VgrG和Hcp蛋白将DypB3152转运至周质空间，随后外膜囊泡（OMVs）将其释放到胞外。该研究不仅解析了非常规酶的分泌路径，还开发了基于OMVs的表面展示平台，显著提升了木质素降解效率，为木质素生物催化提供了新型纳米反应器设计思路。

　　

在自然界中，木质素作为植物细胞壁的主要成分，占据了地球非化石有机碳的30%。这种复杂的芳香族聚合物难以被微生物直接吸收，但某些细菌却能通过分泌木质素降解酶（如过氧化物酶）来分解木质素获取碳源。传统观点认为，这些酶需要依赖信号肽才能被分泌到胞外。然而，Pseudomonas putida A514中的B型染料脱色过氧化物酶DypB₃₁₅₂却打破了这一认知——它缺乏任何已知的信号肽，却依然能出现在胞外空间。这一矛盾现象引发了科学家的强烈兴趣：这种"非常规"酶究竟如何穿越细菌的双层膜系统？

为解答这一谜题，Congying Liang、Lu Lin等团队在《Communications Biology》发表了突破性研究。他们通过周质蛋白质组共表达网络分析，发现DypB₃₁₅₂与VI型分泌系统（T6SS）和外膜囊泡（OMVs，即0型分泌系统T0SS）组分存在显著相关性。随后的实验犹如一场精密的"分子侦探"工作：通过构建系列基因敲除株，研究人员证实T6SS₀₁₃₇基因簇中的VgrG₀₁₃₂和VgrG₂₄₅₅是DypB₃₁₅₂跨内膜运输的关键载体，缺失这两个基因会使周质DypB₃₁₅₂减少63-65%。共免疫沉淀实验则捕捉到了DypB₃₁₅₂与VgrG₀₁₃₂、Hcp₀₁₃₇的相互作用，揭示了三者可能形成转运复合体。

3152的胞外分泌'>

研究团队进一步发现，完成内膜穿越的DypB₃₁₅₂会被OMVs捕获并释放到胞外。电镜观察显示，这些直径60-150 nm的囊泡如同"分子快递车"，将酶运输至木质素富集区域。但天然OMVs的效率有限——DypB₃₁₅₂被包裹在囊泡内部，难以接触底物。为此，研究人员巧妙改造OMVs，将DypB₃₁₅₂与膜蛋白SlyB或LolB融合表达，使其展示在囊泡表面。这种"纳米生物反应器"使酶活性提升至0.87 U/mg，推动木质素利用率提高2.4倍。

关键技术方法包括：1）周质蛋白质组共表达网络构建；2）T6SS基因簇的CRISPR-Cas9系统编辑；3）DypB₃₁₅₂与VgrG/Hcp的共免疫沉淀验证；4）OMVs的分离纯化及表面展示系统构建；5）傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析木质素降解产物。

Periplasmic proteome reveals T6SS and T0SS potentially participate in the DypB₃₁₅₂ secretion

通过比较葡萄糖和木质素培养条件下的周质蛋白质组，发现T6SS₀₁₃₇组分（如DUF1795₀₁₃₁、VgrG₀₁₃₂）和OMVs相关蛋白（OprD₄₁₆₈、BamB₃₁₃₀）与DypB₃₁₅₂表达呈正相关，暗示二者参与分泌过程。

Periplasmic DypB₃₁₅₂ secretion is dependent on the VgrG proteins

四重vgrG基因敲除株（AΔvgrG）使周质DypB₃₁₅₂减少77%，其中VgrG₀₁₃₂和VgrG₂₄₅₅贡献最大。互补实验证实该表型可被逆转。

The periplasmic DypB₃₁₅₂ transportation is mediated by T6SS₀₁₃₇

T6SS₀₁₃₇五基因缺失株（AΔ5-0132）使周质DypB₃₁₅₂降低71%，证实该簇参与运输。CoIP-MS鉴定出DypB₃₁₅₂与Hcp₀₁₃₇的直接互作。

T0SS mediates extracellular secretion of DypB₃₁₅₂

Western blot和蛋白酶K消化实验证实DypB₃₁₅₂位于OMVs内部，而非表面。T6SS缺陷不影响OMVs包装，表明两系统功能独立。

The DypB₃₁₅₂ display platform by OMVs

表面展示工程使OMVs携带的DypB₃₁₅₂活性提升8倍，ΔtolA突变进一步增加囊泡产量，最终使菌株在木质素培养基中生长量提高2.6倍。

这项研究首次揭示了T6SS与OMVs协同的非常规酶分泌机制，突破了"信号肽依赖"的传统认知。其科学价值体现在三方面：1）为微生物适应贫营养环境提供了新的进化视角；2）开发的OMVs表面展示技术为木质素高值化利用提供了可扩展平台；3）提出的"交叉转运模型"为其他非常规蛋白分泌研究提供了范式。正如作者指出，这种将现有细胞系统"变废为宝"的策略，展现了微生物在资源竞争中的惊人智慧。