新型滑行色谱柱的保留效能研究：DNA分离技术中琼脂糖凝胶电泳的替代方案

本文推荐了一种基于超高效液相色谱(UHPLC)系统的新型滑行色谱(SC)技术，该技术通过优化流动相条件(流速0.1-1.5 mL/min、TAE缓冲液4-400 mM、温度23-80°C)实现了双链DNA(dsDNA)的高效分离。相比传统琼脂糖凝胶电泳(AGE)，该GT×ResolveTM 250 ?色谱柱在准确度(±0.3%)、速度(×20)、灵敏度(×10)和峰容量(×2)方面具有显著优势，为基因治疗和定向进化研究提供了新工具。

　　

滑行色谱(SC)是1988年由Boyes和Kasai共同发现的用于双链DNA(dsDNA)生物大分子分离的技术。尽管早期有大量研究，但由于颗粒化学和尺寸限制、缺乏UHPLC系统、应用范围狭窄以及对其复杂保留机制理解有限，SC在1990年代末被弃用。近年来，随着生物惰性UHPLC技术的发展，SC在细胞和基因治疗以及定向进化领域重新受到关注，特别适用于超大DNA/RNA分子的表征。

<理论>

从基础理论角度看，SC是一种非平衡分离技术，利用dsDNA/dsRNA生物大分子的弱熵弹性。这些大分子具有约150个碱基对单位的持久长度（dsDNA为3.4 ?，dsRNA为2.9 ?）和与其持久长度成正比的弛豫时间。研究表明，在随机填充的亚3μm颗粒柱中产生的剪切力(1-2 pN)足以使DNA分子延伸至其全长的80%。因此，dsDNA/dsRNA以细长"蠕虫"形态迁移，通过蠕动模式沿柱移动。值得注意的是，UHPLC柱中的剪切力远低于dsDNA螺旋轴约65 pN的过度拉伸转变力和磷酸二酯键约1000 pN的共价断裂力。

<化学试剂>

本研究使用Fisher Scientific的Optima?超纯水和10×TAE缓冲液。DNA样品包括：1 kb DNA梯度(1-10 kbp)、λ-DNA BstII酶切产物(1.3-8.5 kbp)、λ-DNA HindIII酶切产物(2-23.1 kbp)和λ-DNA单酶切混合物(1-48.5 kbp)。

<新型sc柱的外孔隙率>

SC柱最关键的结构参数是其外孔隙率(ε_e)，它直接影响DNA生物分子所受的剪切力。间隙线速度(u)与ε_e成反比，定义为u=F_v/(ε_eπr_c²)，其中r_c为柱内径。

<结论>

本研究证实，当流体动力学色谱(HDC)和滑行色谱(SC)机制共同作用时，2.5μm二醇键合BEH颗粒填充的SC柱(4.6×300 mm)对1.5-48.5 kbp线性dsDNA片段能达到最佳分离效果。