综述：一锅法等温核酸扩增辅助CRISPR/Cas检测技术：挑战、策略与展望

这篇综述系统阐述了CRISPR/Cas系统作为新兴分子诊断技术与等温核酸扩增（INA）联用面临的挑战，重点探讨了通过物理隔离、组分优化和集成设备开发等策略实现高效"一锅法"检测的路径，为开发快速、低成本、高灵敏度的下一代POCT（床旁检测）工具提供了前瞻性指导。

　　

引言

CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统作为微生物适应性免疫系统的核心组件，凭借其高特异性和高效性正推动分子诊断领域的革命性发展。Cas12和Cas13系统通过反式切割机制实现直接信号输出，但其灵敏度（皮摩尔至飞摩尔级）难以满足临床需求，需结合环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）等INA技术进行预扩增。传统两步法存在操作复杂和气溶胶污染风险，而"一锅法"CRISPR平台通过整合反应步骤，成为实现快速、经济、高灵敏度诊断的理想解决方案。

挑战

开发高效"一锅法"检测面临三大核心挑战：

模板与引物降解

Cas12a的顺式切割会降解作为RPA模板的双链DNA，其反式切割活性则可能非特异性降解扩增引物。例如在RT-LAMP-CRISPR/Cas12b系统中，Cas12b对初始LAMP产物的降解导致扩增信号减弱。直接混合INA与CRISPR组件通常会导致灵敏度下降，如某研究报道一锅法检测铜绿假单胞菌时灵敏度降低且需时超过1小时。

缓冲体系不兼容

INA与CRISPR系统对Mg²⁺等关键试剂的浓度需求存在冲突。例如CRISPR/Cas缓冲液中的Mg²⁺可能抑制RPA聚合酶系统活性，而Cas12a的切割效率又高度依赖Mg²⁺浓度。单链DNA结合蛋白等辅助因子可能同时结合crRNA，形成功能干扰。

温度条件冲突

多数Cas酶（如Cas12a/Cas13a）最适温度为37°C，而LAMP（55-65°C）、RPA（35-42°C）等INA技术需要更高温度环境。虽然源自耐热菌的Cas12b可在37-65°C工作，但温度适配性仍限制技术组合选择。

策略创新

时空隔离技术

空间维度：采用气柱/石蜡油分隔（如Cas12aVDet将Cas12a固定在管壁）、管盖储存CRISPR试剂（opvCRISPR）等方法实现物理隔离。石蜡相变法（如one-pot-RPA-CRISPR/Cas12a）利用熔点特性实现可控混合。

时间维度：光控技术通过PC linker封闭crRNA（灵敏度提升2个数量级），或采用6-硝基胡椒基氧甲基（NPOM）修饰实现紫外激活。POIROT平台通过2′-羟基酰化实现序列无关的crRNA调控。

组分工程化改造

crRNA优化：利用非经典PAM序列（如CTTV）延缓Cas12a激活，sPAMC平台使检测速度媲美单独扩增。AIOD-CRISPR采用双PAM-free crRNA避免模板切割。

Cas蛋白改造：通过AlphaFold预测BrCas12b结构，引入疏水突变提升热稳定性（SPLENDID系统）。工程化PAM相互作用域可平衡扩增与切割效率。

集成设备开发

管中管系统：ECS-CRISPR采用内管储存CRISPR试剂，通过离心或针刺破膜实现可控混合。STAR平台利用毛细通道自动连接两系统。

微流控芯片：LOC-CRISPR整合核酸提取、RPA扩增与CRISPR检测，25分钟完成呼吸道病毒筛查。离心微流控（POCMT）通过碟式设计实现10种病原体同步检测。

未来展望

提升灵敏度需开发高活性Cas变体与兼容缓冲体系；数字CRISPR和信号级联放大助力绝对定量；Cas10/cOA信号通路和Cas14的SNP识别能力将拓展检测维度。人工智能可加速组分优化与设备设计，便携式集成设备（如NuRapid）推动POCT应用。尽管存在商业化挑战，一锅法CRISPR检测技术仍有望成为下一代分子诊断的核心平台。

（注：全文严格基于原文内容缩编，所有技术细节均保留原始文献数据支撑）