综述：基因编辑工具促进叶绿体基因工程的发展

这篇综述系统阐述了基因编辑工具（CRISPR/Cas、TALEN、碱基编辑器BEs等）在叶绿体基因工程（CGE）中的应用进展，重点分析了其在提高作物产量、抗逆性和药用成分合成等方面的潜力，同时探讨了核-质互作机制、递送策略（如纳米载体）等关键技术挑战，为可持续农业发展提供了新思路。

　　

基因编辑工具推动叶绿体基因工程革新

叶绿体表达系统的独特优势

叶绿体基因工程（CGE）凭借多拷贝基因组、母系遗传特性及原核样操纵子结构，可规避核转基因的基因沉默风险。单个植物细胞含约10,000个叶绿体基因组拷贝，使外源蛋白表达量高达叶片总蛋白的70%。例如，嗜热纤维素酶在叶绿体中的超表达即达到这一水平。

基因编辑工具的原理革新

CRISPR/Cas系统通过sgRNA引导Cas核酸酶靶向切割DNA，其中Cas9在PAM序列上游3 bp处产生双链断裂（DSBs）。新型碱基编辑器如胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE），能实现C→T或A→G的精准转换，而无需DSBs。DddA衍生的线粒体碱基编辑器（DdCBEs）通过TALE阵列靶向，实现链选择性编辑。

农业应用突破

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  产量提升：敲除水稻OsMGD2基因导致籽粒数减少43.8%，而过表达LsNRL4则使叶片直立度增加，促进密植光合效率。

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  抗逆强化：OsGL1-11突变体因蜡质合成缺陷表现出低温敏感性，而hsa1突变体在高温下呈现白化表型，揭示了温度响应新靶点。

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  代谢调控：番茄SlG3基因编辑使类胡萝卜素合成显著降低，而SlMIR164A敲除加速叶绿体发育，提升果实糖酸比。

挑战与未来方向

1. 1.

   基因组空白：仅约800种植物完成叶绿体基因组测序，不足开花植物物种的0.6%。

2. 2.

   递送瓶颈：纳米载体（如脂质体）通过网格蛋白依赖的内吞途径穿透叶绿体双层膜，但效率仍需优化。

3. 3.

   编辑精度：TALEDs通过整合尿嘧啶糖苷酶（UDG），将旁观编辑突变率从45%降至4.5%，为Rubisco酶rbcL基因（M309I/D397N突变）的定向进化提供可能。

合成生物学新策略

人工设计的五肽重复蛋白（PPR）可特异性识别叶绿体RNA，而肽适体通过干扰靶蛋白功能实现“无痕编辑”。核-质共表达系统的建立（如微藻单叶绿体体系）将打破异质化限制，为生物制药（如疫苗生产）开辟新途径。

全文通过整合前沿工具与生物学机制，勾勒出CGE在精准农业和合成生物学中的变革潜力。