基于FimH细胞表面展示的酿酒酵母生物膜系统实现人溶菌酶高效连续分泌

为解决重组蛋白连续生产难题，研究人员通过将大肠杆菌黏附素FimH展示于酿酒酵母（S. cerevisiae）表面，显著增强生物膜形成能力（提升80-150%），建立人溶菌酶（hLYZ）连续分泌系统，使hLYZ活性达113.1 U/mL，生产率提升77.4%，为重组蛋白工业化生产提供新策略。

　　

在生物制药领域，重组蛋白的连续生产一直是科学家们追逐的"圣杯"。传统发酵工艺面临细胞活性维持困难、生产效率低下等挑战，尤其对于分子量较大的蛋白质更是如此。生物膜（biofilm）作为一种微生物自我保护机制，能够显著增强细胞对环境压力的耐受性，但此前主要应用于乙醇、氨基酸等小分子化合物的连续生产，在重组蛋白领域鲜有突破。

这项发表在《Systematic and Applied Microbiology》的研究开创性地将细菌来源的黏附素FimH引入真核微生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），构建了一个高效的生物膜发酵系统。研究人员通过细胞表面展示技术，将大肠杆菌（E. coli）的FimH蛋白与四种不同的酵母锚定蛋白（Sag1C、Sed1、Cwp2和Ccw12）融合表达，显著提升了酵母细胞的生物膜形成能力。在此基础上，研究人员建立了人溶菌酶（human lysozyme, hLYZ）的连续分泌系统，实现了长达350小时的稳定生产。

关键技术方法包括：1）采用α-factor和Yap3-TA57信号肽引导的细胞表面展示系统；2）通过免疫荧光染色和结晶紫染色分别验证FimH展示效率和生物膜形成能力；3）构建双表达框质粒实现FimH展示与hLYZ分泌的协同表达；4）以棉纤维为载体建立生物膜连续发酵系统；5）基于微球菌（Micrococcus lysodeikticus）裂解法的hLYZ酶活检测。

研究结果部分：

细胞表面展示系统优化

通过绿色荧光蛋白（GFP）报告系统筛选出Sag1C和Sed1作为最优锚定蛋白。免疫荧光检测证实FimH成功展示在酵母表面，其中Sed1展示系统使生物膜形成能力提升150%，显著高于其他锚定蛋白。添加D-甘露糖可竞争性抑制FimH介导的细胞黏附，反向验证了该系统的特异性。

游离细胞发酵性能评估

在传统摇瓶发酵中，仅表达hLYZ的对照菌株BY4742-hlyz产量最高（111.7 U/mL），而同时表达FimH的菌株因代谢负担增加导致产量下降。值得注意的是，Sag1C-FimH展示系统仍保持80.8 U/mL的hLYZ活性，为后续连续发酵奠定了基础。

生物膜连续发酵突破

在添加20 g/L棉纤维的生物膜系统中，BY4742-Sag1C-hlyz菌株表现出色，平均hLYZ活性达113.1 U/mL，较对照提升172%，生产率提高至2.36 U/mL/h。增加棉纤维载量至40 g/L虽提高细胞总量，但因传质限制未能进一步提升产量。

这项研究首次实现了细菌来源生物膜形成基因在真核微生物中的异源表达，突破了酵母生物膜强化技术的传统思路（如过表达FLO家族基因）。通过将FimH展示与棉纤维载体相结合，建立的"细胞-载体"双重黏附系统，为重组蛋白的工业化连续生产提供了新范式。研究不仅证实了生物膜发酵在大分子蛋白生产中的可行性，更展示了对14.3 kDa蛋白质的长期稳定分泌能力，为后续更大规模的应用奠定了理论基础。

特别值得注意的是，该系统的成功暗示了跨物种生物膜调控元件的通用性潜力，为合成生物学领域的模块化设计提供了新思路。虽然目前仅在实验室规模实现，但研究者指出，生物膜发酵在乙醇工业中已有3,400 m³反应器的成功先例，这为蛋白质生产的规模化应用提供了宝贵参考。未来通过优化反应器设计、解决溶氧限制等问题，这一技术有望成为生物制药领域的重要生产平台。