棉花中拟南芥PQT3同源基因的功能鉴定：氧化还原稳态与非生物胁迫抗性的关键调控靶点

本研究针对棉花在干旱和盐胁迫下因活性氧(ROS)积累导致的氧化损伤问题，通过CRISPR-Cas12介导的GhPQT3基因敲除，发现该E3泛素连接酶负调控抗氧化防御系统。突变体Ghpqt3-6表现出APX、GPX和SOD活性显著提升，DPPH自由基清除能力增强，叶绿素保留率提高23%，首次证实GhPQT3可作为棉花抗逆育种的分子靶标。

　　

在气候变化加剧的背景下，棉花作为全球最重要的纤维作物，其产量正遭受干旱、盐碱等非生物胁迫的严重威胁。这些胁迫会引发植物细胞内活性氧(ROS)的爆发性积累，导致细胞膜损伤、光合作用受阻甚至程序性死亡。虽然植物已进化出复杂的抗氧化系统来维持氧化还原平衡，但关键调控元件在作物中的功能仍不清楚。拟南芥中发现的Paraquat Tolerance 3(PQT3)基因编码一种RING型E3泛素连接酶，能通过降解PRMT4b蛋白抑制抗氧化基因表达，但其在棉花中的功能尚未解析。

为揭示这一科学问题，巴基斯坦旁遮普大学分子生物学卓越中心的Sahar Sadaqat团队在《Plant Stress》发表重要成果。研究采用生物信息学分析鉴定棉花GhPQT3同源基因，通过CRISPR-Cas12a技术构建敲除突变体，结合qRT-PCR、酶活检测、DPPH自由基清除实验及叶盘分析等技术，系统评估了突变体的抗逆表型。

3.1 棉花PQT3的保守性分析

通过序列比对发现GhPQT3在A12和D12染色体上存在两个同源基因，与拟南芥AtPQT3具有高度保守的RING结构域和锌指结构。系统发育分析显示双子叶植物PQT3形成独立分支，暗示其在进化过程中的功能保守性。

3.2 胁迫响应特征

qRT-PCR显示GhPQT3在盐(NaCl)、干旱(PEG)和氧化(H₂O₂)胁迫下6小时内表达量骤降，尤其在复合胁迫中几乎完全沉默，表明其参与早期胁迫响应。

3.3-3.4 基因编辑体系构建

设计靶向编码区中段的gRNA，通过Gateway克隆构建CRISPR-Cas12a载体。Sanger测序证实Ghpqt3-6株系编辑效率达98.38%，qRT-PCR显示其PQT3表达降低85%。

3.5-3.8 抗氧化系统激活

突变体中APX、GPX和SOD基因表达提升2倍，酶活检测显示Ghpqt3-6的GPX活性在复合胁迫下比野生型高17 U/mg。DPPH实验证实其IC₅₀值降低36%，表明自由基清除能力显著增强。

3.9-3.12 表型验证

叶盘实验显示突变体在10 mM H₂O₂处理5天后坏死面积减少21%，近红外成像分析发现其叶绿素保留率提高23%。气孔导度和光合速率测定进一步证实突变体具有更好的碳同化能力。

这项研究首次阐明GhPQT3通过泛素化途径负调控棉花抗氧化防御的分子机制。该基因的敲除使PRMT4b蛋白稳定表达，进而激活APX、GPX等抗氧化酶系统，形成"预适应"保护机制。这不仅为理解作物胁迫响应提供了新视角，更为分子设计育种提供了精准靶标——通过调控PQT3-PRMT4b模块，可培育兼具高产与抗逆的新种质。该发现对保障全球棉花产业可持续发展具有重要战略意义。