NEGR1缺陷通过扰乱Leydig细胞脂质代谢和类固醇生成影响睾酮水平与行为模式的机制研究

本研究揭示了神经元生长调节因子1(NEGR1)在睾丸Leydig细胞中的关键作用，通过构建Negr1-/-小鼠模型，发现NEGR1缺失会导致胆固醇转运障碍、睾酮合成酶表达下调，引发血清睾酮水平降低（仅为野生型25%）、精子形态异常率增加等表型。研究创新性证实外源性睾酮可逆转KO小鼠的抑郁样行为和性功能障碍，为代谢-生殖-精神疾病关联机制提供了新视角。

　　

在探索精神疾病与代谢异常关联机制的科学前沿中，神经元生长调节因子1(NEGR1)因其在抑郁症和肥胖症中的风险基因身份而备受关注。这个主要表达于大脑的细胞粘附分子，却在敲除小鼠中表现出令人费解的外周组织异常——脂肪堆积、肌肉萎缩，甚至繁殖能力下降。这些现象暗示NEGR1可能具有超越神经系统的生物学功能，特别是在脂质运输这一基础生命过程中。当单细胞测序技术意外发现NEGR1是人类Leydig细胞的分子标志物时，一个关键问题浮出水面：这个蛋白是否在男性生殖系统的"激素工厂"中扮演着尚未认知的角色？

为解开这个谜团，韩国忠南国立大学的Poudel Rekha团队在《Journal of Lipid Research》发表的研究，首次系统揭示了NEGR1通过调控睾丸Leydig细胞的胆固醇代谢影响睾酮合成的分子机制。研究人员采用基因敲除小鼠模型，结合组织病理学分析、脂质染色、激素检测和行为学评估等多维度方法，发现NEGR1缺陷会导致睾酮合成酶3βHSD、StAR和Cyp17A1表达显著下调，使血清睾酮水平骤降至野生型的1/4。更引人注目的是，外源性睾酮补充不仅能改善敲除小鼠的性行为障碍，还能缓解其焦虑抑郁样表型，为理解激素-行为轴提供了直接证据。

关键实验技术

研究采用Negr1^-/-C57BL6小鼠模型（n=7-13/组），通过ELISA检测血清/睾丸睾酮和雌二醇水平，qRT-PCR和Western blot分析基因表达，免疫荧光共定位确定蛋白分布，BODIPY493/503和filipin染色观察脂滴积累，H&E染色评估组织病理变化，并建立TM3-TetOne-NEGR1诱导表达细胞系验证功能。行为学实验包括10分钟自发活动测试和30分钟交配行为记录。

Negr1-deficient male mice showed low sexual activities

繁殖实验显示Negr1^-/-小鼠获得首胎时间延长1.7倍，但每窝仔数无差异。行为学分析发现KO小鼠攀爬、嗅探等探索行为减少47%，而理毛行为增加，暗示焦虑水平升高。交配测试中，突变体的骑乘频率降低48%，骑乘潜伏期延长2.6倍，首次插入时间增加2倍，证实NEGR1缺失导致性动机下降。

Negr1 is highly expressed in the Leydig cells of the testis

免疫组化揭示NEGR1主要定位于睾丸间质区，与Leydig细胞标志物3βHSD和StAR共定位，在管周肌样细胞中也有表达。值得注意的是，敲除小鼠的这些标志蛋白信号减弱且分布紊乱，提示NEGR1对睾丸细胞结构维持至关重要。

Negr1^-/- mice had low testosterone levels and highly disorganized testis

12周龄KO小鼠血清睾酮仅为野生型25%，睾丸睾酮同步下降，但睾丸内雌二醇水平反常升高3.6倍。器官称重显示睾丸、附睾和精囊重量显著减轻，组织学观察到生精小管上皮萎缩、生精细胞耗竭等退行性变，而5周龄小鼠尚未出现这些变化，说明缺陷随年龄加重。

Decreased expression of testicular steroidogenic enzymes in Negr1^-/- mice

qPCR和Western blot证实KO小鼠睾丸中3βHSD、StAR和Cyp17A1 mRNA和蛋白水平均显著降低，雄激素受体(AR)表达同步下降。免疫染色显示这些酶阳性细胞数量减少，勾勒出NEGR1调控睾酮合成的分子图谱。

Loss of Negr1 causes defects in spermatogenesis

附睾尾精子计数显示KO小鼠精子数量减少78%，活力显著下降。H&E染色发现大量畸形精子，包括无头、双头、卷尾等异常形态（占总数30%以上），附睾管腔精子数量锐减，上皮结构紊乱。

Impaired cholesterol and lipid trafficking in testicular cells

filipin染色显示KO小鼠睾丸胆固醇沉积增加，BODIPY染色证实脂滴异常积累从间质区扩散至生精小管内。qPCR检测到脂质代谢相关基因Fabp4、Lpl、Plin2表达上调，Western blot显示脂滴包被蛋白Plin1/2和TIP47蛋白水平显著升高，说明NEGR1缺失导致睾丸脂质运输障碍。

Exogenous testosterone increased the mating behavior of Negr1^-/- mice

原代Leydig细胞培养显示KO组睾酮分泌量持续低于野生型，而诱导NEGR1表达的TM3细胞睾酮产量增加。睾酮治疗（25mg/kg×4天）使KO小鼠攀爬和嗅探行为恢复至正常水平，骑乘频率提升，潜伏期缩短。有趣的是，外源睾酮还降低了睾丸内脂滴蛋白Plin1/2含量，提示激素反馈调节脂代谢。

这项研究开创性地将NEGR1的功能版图拓展至生殖内分泌领域，阐明其通过NPC2非依赖性途径参与胆固醇转运的新机制。临床意义上，为解释男性不育伴发抑郁焦虑提供了"激素-行为"轴的理论框架，提示对NEGR1基因变异人群应关注生殖激素水平。技术层面，建立的TM3-TetOne-NEGR1诱导系统为研究脂质-激素偶联提供了新工具。未来研究可深入探索NEGR1与NPC2在胆固醇运输中的协同作用，以及睾酮替代疗法对NEGR1相关精神症状的长期疗效。